流式細胞術(FC)方案
原理
流式細胞術是一種高效的細胞分析技術,它可以對單個細胞進行快速、準確的分析和分類。該技術的原理是將細胞懸浮在液體中,通過流式細胞儀對細胞進行檢測和分析。
流式細胞儀是一種高科技儀器,它可以將細胞懸浮液通過微細管道引入儀器中,然后通過激光束對細胞進行檢測。激光束照射到細胞上時,會產生散射光和熒光信號。這些信號可以被流式細胞儀捕捉并記錄下來。流式細胞術的原理是基于細胞的特性進行分類和分析。細胞的特性包括大小、形狀、表面分子、細胞器、染色體等。通過對這些特性的分析,可以對細胞 進行分類和鑒定。
流式細胞術可以用于許多不同的應用,包括細胞分析、細胞排序、細胞計數、細胞增殖等。例如,在癌癥研究中,流式細胞術可以用于檢測癌細胞的數量和類型,以及評估治療效果。在免疫學研究中,流式細胞術可以用于檢 測免疫細胞的數量和功能。
流式細胞術的優點是快速、準確、高通量和高靈敏度。它可以對大量的細胞進行分析,并且可以檢測到非常低濃度的細胞。此外,流式細胞術還可以對細胞進行多參數分析,即同時檢測多個細胞特性。
用途
通過對細胞的特性進行分析和分類,可以更好地理解細胞的功能和疾病的發生機制。
步驟
1. 樣品準備
● 細胞樣品的制備
(1) 對于懸浮細胞,以1000rmp 離心收集細胞;對于貼壁細胞,用胰蛋白酶消化細胞,并1000rmp 離心收集貼壁細胞。細胞密度需達到1*106。
(2) 用預冷的PBS 沖洗細胞3次;
● 組織樣品的制備
(1) 通過胰酶或膠原酶剪切組織和消化組織腫塊。
(2) 在顯微鏡下觀察單個分散細胞并終止消化。胰酶通常用于消化間質較 少的組織,而膠原酶則用于有膠原結構的組織。 一般胰酶作用時間為 20-60min, 而膠原酶作用時間為4-48h。
2. 固定和滲透作用
樣品的固定和滲透過程是決定實驗成功與否的關鍵。交聯劑(如4%甲醛、 10%福爾馬林和戊二醛)和變性劑(如70%乙醇和90%乙醇)常被用作固定劑。交聯試劑與細胞蛋白交聯,變性試劑與膜反應并破膜。因此,如果使用變性試劑進行固定,則不需要對細胞內蛋白進行滲透標記。但必須將0.2% TritonX-100 交聯試劑固定在標記的細胞內蛋白上進行滲透。如果目標蛋白是膜蛋白,則不需要滲透。
(1)70%乙醇4℃固定12h(-20℃ 保存1個月)或4%甲醛室溫固定15min, 0.2% TritonX-100滲透5min(4℃ 保存1周)。如果目標蛋白位于膜上,則 可以忽略其固定。對于細胞內蛋白質,需要固定。
(2)1000rpm 離心,PBS 洗三次。
3. 封閉
這一過程是為了減少抗體與其他非特異性蛋白質之間的非特異性結合。常用10%正常山羊血清作為阻斷液(品種必須與二抗一致)。
4. 抗體孵育
(1) 根據推薦的稀釋比例制備一抗溶液。
(2) 一抗4℃孵育過夜。當用到正常兔或小鼠 |gG 時,我們需要設置陰性對照。
(3) 用PBS 沖洗細胞三次。
(4) 在暗處按照推薦的稀釋比例配制二抗溶液。
(5) 二抗4℃孵育30min。
(6) 用PBS 沖洗細胞三次。
(7) 用500 μl PBS重懸檢測。
5. 檢測
將樣品置于黑暗中,盡快用流式細胞儀檢測熒光信號。
常見問題
1. 怎么選擇合適的對照?
(1) 同型對照:使用同型抗體做平行實驗,主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結合。
(2) 陰性細胞對照:使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實驗,主要目的是消除抗體的非特異性結合。
(3) 二抗對照:第二抗體多為熒光標記的多抗,非特異性結合一般較高,可能造成基礎熒光值偏高,設立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
(4) 陽性對照: 一般會使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實驗,主要目的是排除實驗中實驗方法、試劑、操作等實驗的影響因素。
(5) 空白對照:不進行任何標記的細胞,主要目的是用于測定基礎熒光信號 表達值。
2. 收集的細胞通過流式儀檢測時, 一般多少的細胞量合適?
進行流式檢測時,至少需要記錄5000個活細胞, 一般調整細胞密度至 1*10'/100ul 進行流式檢測。
3. FCM 檢測過程中如何設門(gating)?
一般根據散射光進行設門,即我們通常所說的前散(forward scatter, FSC) 和側散(side scatter, SSC)來設門。FSC 的大小與細胞的直徑成正相關,不 同的細胞,細胞越大,其FSC 越大;反之越小。SSC 的大小與細胞內顆粒結構的質量成正相關,不同的細胞,細胞內顆粒結構越復雜,質量越大,其SSC 越大;反之越小。
4. FCM 檢測過程中如何調節補償?
在FCM檢測過程中,如果存在多色,則必須進行熒光補償調節。調節補償首先要知道雙陰性細胞的情況,其次,必須要用單陽和雙陰性細胞。只有在有陰性細胞作為參照的情況下,才能既不會過多又不會過少地調節補償。
5. FCM 檢測時,每次實驗的細胞數一定要相同嗎?
FCM 檢測時,若不進行細胞計數而憑感覺隨意進行實驗會直接影響實驗結 果。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少,那么熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少。由此可見,不同的細胞量會影響最終的實驗結果。因此,在準備樣本時,必須進行細胞計數,使每個分組及每次實驗的細胞數保持一致。
6. FCM 檢測時,如果存在多色分析,應該如何進行配色呢?
在FCM 檢測過程中,如果存在多色分析,雖然可以通過熒光補償來消除熒光光譜重疊的影響。但調節補償過大在一定程度上仍然會影響測值的準確性,因此,我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。