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單抗制備技術對比

單克隆抗體(Monoclonal antibodies,mAb)是由B細胞產生,并能特異性靶向抗原的免疫球蛋白。單克隆抗體不僅是生物化學、分子生物學和醫學研究中必不可少的工具,其在臨床治療上的應用也以革命性的速度改進了多種疑難雜癥的治療方法。

1975年Köhler和Milstein提出的雜交瘤技術(Hybridoma technology),使得大量獲得單克隆抗體成為可能,為基礎研究及其臨床應用提供了無限潛力。其他科學和技術進步也促進了單克隆抗體的發展、豐富了單克隆抗體的制備方法。

經過近50年的發展,單克隆抗體制備方法不再局限于免疫小鼠的淋巴細胞術,噬菌體展示技術(Phage display)、人源抗體轉基因小鼠(Human antibody-producing mice)和單B細胞抗體技術(Single B cell antibody technology)也都陸續登上舞臺。這些方法雖然有各自的局限性,但都已廣泛應用于單克隆抗體篩選。同時,這些技術都不完全是獨立存在的,如果能充分利用各技術的優點,采用靈活的方法將各技術優化組合就能更加高效、快速地進行抗體開發。


1. 雜交瘤技術

雜交瘤技術是一種將B細胞與骨髓瘤細胞融合生產小鼠單克隆抗體的傳統方法,是目前應用最廣泛的單克隆生產技術。在這種技術中,首先收集免疫小鼠的B淋巴細胞,并將其與BALB/c小鼠骨髓瘤細胞融合,從而形成永生化的雜交瘤細胞。然后篩選雜交瘤細胞,鑒定出能生產特異性抗體的單克隆細胞株。十幾年后,1988年,兔單克隆抗體制備方法首次被《Science》雜志報道 [1]。該研究使用小鼠-兔異種雜交瘤方法生產兔單克隆抗體,但鼠-兔異種雜交瘤細胞分泌抗體的效率較低、不穩定,且無法長時間分泌抗體。時間進展到90年代中期,1995年,《PNAS》報道了能穩定生產兔單抗的兔-兔雜交瘤細胞 [2]。但兔雜交瘤細胞也被證明不如常規鼠雜交瘤細胞穩定,這大大阻礙了其實驗室水平的廣泛使用。并且,由于融合和轉化效率低下,使用兔雜交瘤細胞生產單克隆抗體在應用推廣中受到了極大的限制。

經過多年發展及應用,雜交瘤技術作為一種成熟的產生鼠單克隆抗體的方法已被廣泛應用于多種抗體的生產。然而,由于缺乏合適的骨髓瘤融合伴侶,雜交瘤技術一直局限于免疫嚙齒動物。20世紀80年代,《PNAS》報道了一種應用人雜交瘤技術生產治療用抗體的文章 [3]。利用該方法可以在無額外修飾的情況下產生天然的人源抗體,并用于臨床治療。隨著融合伴侶和電融合技術的發展,人雜交瘤細胞融合成功率逐步增加,這將在未來促進治療性抗體的開發。


2. 噬菌體展示技術

1990年開始,噬菌體展示技術被視為一種新的產生單克隆抗體的方法。這種方法是從淋巴細胞中收獲抗體可變區基因(V gene)全集,克隆VHs和VLs的組合并與外殼蛋白融合后表達于絲狀噬菌體表面,然后篩選表達特異性抗體的噬菌體。與受限于嚙齒動物的雜交瘤技術相比,噬菌體展示技術已經成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物種中篩選和分離單克隆抗體 [4,5]。2000年,Rader等人首次介紹了應用噬菌體展示技術生產兔單克隆抗體的全過程 [6]。在這篇文章中,Rader等人用噬菌體展示技術篩選和人源化的人A33兔抗體,不僅對人A33抗原有高特異性,且保留高親和力。目前,噬菌體展示技術因為其高效、簡便及體外控制在原核或真核系統中原則參數的能力正逐步成為生產治療用抗體的重要技術平臺。

隨著我們對抗體結構、功能和序列多樣性研究的不斷深入,除了原有的抗體庫外,一種新的合成抗體庫技術也在不斷發展。例如,HuCAL&Ylanthia文庫中,為了使篩選出的人源抗體能更好的進行分子識別,將精確設計的序列插入抗原結合位點,并優化設計多種可變重鏈、輕鏈框架區域 [7-10]。隨著文庫設計和篩選方法的不斷進步,合成抗體文庫將成為快速生產具有高特異性和高親和力單克隆抗體不可或缺的工具。


3. 人源抗體轉基因小鼠

1985年,Alt等人首次提出將人抗體基因引入小鼠種系并使用轉基因小鼠中產生人抗體的想法 [11,12]。隨著基因編輯技術的進步,使用人源抗體轉基因小鼠生產人源化抗體已不再是天方夜譚。與其他技術相比,使用人源抗體轉基因小鼠有許多優勢,如無需人源化、具有更多的生物多樣性,且由于體內成熟具有天然的親和力。但是,人免疫球蛋白體量龐大對轉基因小鼠抗體生產是一個巨大的挑戰。為了克服這些困難,研究人員們通過使用不同策略已成功地獲得轉基因動物表達的人源抗體庫,如全人源抗體小鼠和嵌合人源抗體小鼠等。


4. 單B細胞抗體技術

雖然雜交瘤技術和噬菌體展示技術已經在單克隆抗體生產中廣泛應用,但它們依然存在較難克服的缺點制約著抗體生產過程。近些年,為了克服雜交瘤技術細胞融合效率低,噬菌體展示技術導致重鏈、輕鏈的天然同源配對丟失等問題,單B細胞抗體技術正被逐步開發和應用。

簡單來說,單B細胞抗體技術包含以下幾個步驟:

a. 從外周血或免疫器官中初步提取淋巴細胞;

b. 使用磁性活化細胞分選(MACS)或熒光活化細胞分選(FACS)技術鑒定和分離出特定的B細胞;

c. 將分離出的B細胞進行單細胞培養;

d. 使用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和抗體特異性引物鑒定單B細胞分泌抗體的特異性;

e. 擴增特異抗體基因;

f. 將抗體基因克隆到表達載體中,并在細菌或細胞系統中表達;

g. 純化表達產生的抗體,并用ELISA等方法進行評估。

單B細胞抗體技術現在已廣泛用于人和小鼠單克隆抗體生產,如一些治療性中和單抗,可用于治療多種疾病,包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染性疾病亡 [13,14]。

方法 雜交瘤技術 人源抗體轉基因小鼠 噬菌體展示技術 單B細胞抗體技術
優勢
  • 技術成熟
  • 研發成本低
  • 可用雜交瘤技術獲得人源抗體
  • 良好的免疫原性
  • 親和力高
  • 基因來源靈活
  • 隨機庫可以避免免疫耐受
  • 可以靈活、特異地調整設計方案
  • 可長時間保存
  • 無需雜交瘤融合
  • 制備周期短
  • 重鏈、輕鏈天然配對
  • 無需合成基因
  • 可直接獲得各物種抗體
劣勢
  • 周期長
  • 融合率低
  • 需要進行人源化
  • 存在免疫耐受
  • 依然有鼠抗產生
  • 難以免疫毒性抗原
  • 重鏈輕鏈非天然配對
  • 展示效率具有偏好性
  • 需要再次進行功能驗證
  • 需要新鮮樣本
  • 抗原特異性細胞比例低
  • 操作環境要求嚴格

參考文獻

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