如何選擇合適的二抗
日期：2023-07-26 09:28:53
一般來說，二抗與直接附著在靶抗原上的一抗結合。在這個詞中，我們提到兩組抗體，一組是一抗，另一組是二抗。這兩組抗體在各種免疫實驗中都很受歡迎，有些人總是被這兩個群體搞混。如果你還有疑惑，你可以點擊這里。
圖1. 二抗的作用機制
本文主要討論如何選擇合適的二抗。為了解決這一問題，我們收集了二抗的幾個典型問題如下:
1. 一抗的宿主物種是什么?
眾所周知，一抗從何而來，而相應的二抗也是一種針對該物種的抗體。換句話說，二抗是直接針對宿主的一抗。因此，你需要一種二抗，這種二抗與一抗的宿主物種不同，以避免物種反應性。例如，如果您的一抗是小鼠來源的單克隆抗體，則二抗被選擇為抗小鼠二抗(山羊抗小鼠或兔抗小鼠)。如果一抗是由兔血清制備的兔源性多克隆抗體，則相應的二抗需要選擇一種針對兔的二抗。即根據一抗的種類來源，選擇相應的針對該物種的二抗。
2. 一抗的類別(同型)和/或亞類別是什么?
二抗除與一抗的種源一致外，還需與一抗的類或亞類相匹配，尤其是與單克隆抗體協同工作時。而多克隆抗體主要是典型的IgG或IgG樣類免疫球蛋白，因此相應的二抗是抗IgG抗體。
與多克隆抗體相比，單克隆抗體更為復雜。由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，相應的二抗也需要根據這些亞型來選擇。它們最常見于小鼠，偶爾見于大鼠、倉鼠或兔子。例如，如果一抗單克隆抗體是小鼠IgM，則所需的二抗應該是抗小鼠IgM。
如果單克隆一抗是小鼠IgG亞類(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)中的一種，那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合，也可以選擇靶向這一亞類。但如果一抗的亞類不知道，那么你可以選擇抗小鼠IgG F(ab)二抗，它具有識別大多數小鼠免疫球蛋白亞類的能力。在這里，我們整理了免疫球蛋白的類別和子類如下:
- 免疫球蛋白類：IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
- 人免疫球蛋白亞類：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1和IgA2
- 小鼠免疫球蛋白亞類：IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
- 輕鏈：Kappa, Lambda
- 重鏈：IgG (γ)， IgM (mu)， IgA (α)， IgD (δ)， IgE (ε)
當你讀到這里，你可能會覺得選擇一個正確的二級是非常困難的，存在許多類和子類的人類和小鼠IgG(s)。是的，我同意你的觀點。如果想獲得更準確的實驗數據，就應該反復這樣做。
注意：這些IgG的一個共同因子是輕鏈(κ和λ)。換句話說，IgG, IgM, IgA, IgD和IgE都有κ或λ輕鏈。然而，重鏈是特定于類的。
3. 二抗的種類是什么?
一般來說，沒有證據表明二抗的質量存在物種特異性的差異，也就是說，在一般的實驗中，山羊產生的二抗與驢產生的二抗沒有太大的區別。因此，宿主物種的選擇應基于其他標準。
但在一些特殊的實驗中，如雙標實驗中，如果一抗中的一抗是山羊源的，而另一抗是小鼠源的，則相應的二抗分別對山羊和抗小鼠的二抗具有抗性。二抗不能從山羊或小鼠來源中選擇。雙標記的兩種是耐藥的，所以需要選擇第三種抗體來源。
4. 我需要預吸附的二抗嗎?
預吸附抗體又稱交叉吸附抗體，是一種經過處理以消除不需要的免疫球蛋白、抗體片段和/或細胞和組織樣本的反應性，從而提高抗體特異性的抗體。建議使用一種二抗，它預先吸附到你正在檢測的物種。在這里，我們為你列舉了兩種情況，當你必須選擇一個預吸附的二抗。
選擇預吸附抗體，當免疫印跡組織和細胞也有高水平的免疫球蛋白。預吸附的二抗與內源性免疫球蛋白相互作用的可能性較小，從而可能減少非特異性背景。
如果你在同一試驗中使用了兩種不同的二抗(多重標記)，你要確保任何一種二抗都不能相互識別。
5. 我應該選擇什么樣的標簽?
一般情況下，二抗可以是酶標記(辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP, PAP)，熒光標記(FITC, Alexa-Fluor, Qdot)或生物素偶聯。選擇標記的二抗主要取決于特定的實驗。
對于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標二抗，而熒光標記二抗通常用于細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學、組織免疫化學、流式細胞術)。辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的二抗也可用于治療。
如果要將檢測信號放大到更大的程度，可以使用生物素/親和素檢測系統。在一些熒光檢測方案中，需要選擇不同的熒光標記;而金顆粒標記的二抗則更常用于免疫電鏡檢查。
6. 我應該使用親和純化抗體還是IgG部分?
親和純化抗體是通過固相親和層析從其他抗血清蛋白和非特異性免疫球蛋白中分離出單特異性抗體。近年來，親和純化抗體因其特異性強、低背景、靈敏度高、批間一致性好等特點而廣泛流行。
然而，使用親和純化抗體或IgG部分的優勢將取決于預期的結合類型。在某些情況下，純化過程中丟失的IgG部分也被考慮在內，因為它含有高親和力的抗體，特別是當感興趣的抗原量較小時，高親和力的IgG部分尤為重要。一般來說，IgG組分可用于濁度測定。大多數其他免疫測定應使用親和純化抗體。如果你不確定，選擇一種經過親和純化的第二抗體。
7. 什么時候需要F(ab)或F(ab')2片段抗體?
F(ab')2片段:該抗體由兩個Fab片段通過二硫鍵結合抗原組成。在實驗設置中，酶胃蛋白酶在鉸鏈區域下方裂解，因此形成了F(ab')2片段和pFc'片段。這些抗體用于特定情況，例如需要避免攜帶Fc受體的抗體和細胞。
Fab片段:抗原結合(Fab)片段是抗體上與抗原結合的區域。它由重鏈和輕鏈各一個常數域和一個可變域組成。可變結構域包含抗原結合位點，在單體的氨基端包含一組互補決定區。只有一個結合位點并通常用于阻斷內源性免疫球蛋白類。在實驗條件下，木瓜蛋白酶可用于將免疫球蛋白單體裂解為兩個Fab片段和一個Fc片段。
F(ab')2抗體片段用于Fc區可能引起問題的檢測系統。淋巴結、脾臟和外周血制劑等樣本含有帶有Fc受體的細胞(巨噬細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞)，這些細胞可與完整抗體的Fc區結合，導致高本底染色。使用F(ab')2片段確保觀察到的任何抗體結合都不是由于Fc受體。
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