如何選擇合適的抗體
日期：2023-07-26 09:32:25
抗體是科學(xué)研究中不可或缺的一種特殊Y形蛋白質(zhì)。Western blot、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、免疫組化（Immunohistochemistry）、免疫熒光（Immunofluorescence）、染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation）、流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry）等許多實(shí)驗(yàn)都涉及使用抗體。那么，在不同實(shí)驗(yàn)中使用的抗體有什么區(qū)別呢？如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，要自問是否選擇了正確的抗體。
實(shí)際上，即使對(duì)于有豐富實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的研究人員來說，選擇正確的抗體也可能很困難。當(dāng)你在使用相對(duì)不常見的模型系統(tǒng)進(jìn)行研究，或者所研究的蛋白質(zhì)尚未被充分表征時(shí)，市售的抗體可能數(shù)量有限甚至沒有。當(dāng)你在研究一個(gè)在常見模型系統(tǒng)中被充分表征的蛋白質(zhì)時(shí)，可能會(huì)遇到另一個(gè)問題--由于有很多抗體生產(chǎn)商和分銷商提供，你有很多選擇，但也很難做出正確的決定。
好消息是，有許多方法可以簡化選擇過程。在本文中，我們將給出一些建議。本文主要涵蓋以下主題：
1. 特異性的選擇
特異性的選擇主要需要考慮四個(gè)方面：蛋白質(zhì)的特異性、物種的特異性、實(shí)驗(yàn)方法的特異性以及標(biāo)記的特異性。
1.1 蛋白質(zhì)的特異性
什么是蛋白質(zhì)的特異性？一般來說，蛋白質(zhì)的特異性指的是蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)與特定配體結(jié)合的能力。一個(gè)蛋白質(zhì)-配體的例子就是抗體-抗原系統(tǒng)，它們之間的結(jié)合活性可以被描述為高度特異。了解了蛋白質(zhì)的特異性后，理解抗體的特異性將更加容易。每個(gè)單個(gè)抗體蛋白都能夠通過其Y形狀抗體蛋白的可變區(qū)頂端的獨(dú)特抗原結(jié)合位點(diǎn)，與抗原上的一個(gè)唯一表位特異結(jié)合。這種特異性能夠精確檢測目標(biāo)抗原。
圖1. 抗體結(jié)構(gòu)
常數(shù)區(qū)域在一個(gè)給定類型的所有抗體中都是相同的，選擇抗體時(shí)根據(jù)檢測的蛋白質(zhì)，需要了解以下細(xì)節(jié)：
a. 如果重組蛋白并不完整表達(dá)，需要確認(rèn)抗原結(jié)合位點(diǎn)是否位于重組蛋白的序列范圍內(nèi)。
b. 對(duì)于內(nèi)源性蛋白質(zhì)，最好了解它們的剪接和修飾情況。對(duì)于具有特殊表型的蛋白質(zhì)，需要通過比較免疫原序列和感興趣的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序列比對(duì)，以檢查物種的交叉反應(yīng)性。
c. 檢測磷酸化蛋白質(zhì)需要確定特定的磷酸化位點(diǎn)。不同的磷酸化位點(diǎn)意味著可能存在不同的機(jī)制，不能一概而論。
1.2 物種特異性
同源蛋白在不同物種之間存在更多或更少的變異。
a. 大多數(shù)商業(yè)抗體是使用源自人類蛋白質(zhì)序列的重組蛋白或肽段制備的，因此它們可能基于序列同源性與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)。您需要查看抗體數(shù)據(jù)表中標(biāo)明的物種反應(yīng)性。
b. 對(duì)于一些稀有物種，很難找到適用的抗體。在這種情況下，您應(yīng)該通過序列比對(duì)選擇使用同源序列產(chǎn)生的抗體，但通常制造商不會(huì)接受關(guān)于質(zhì)量的投訴。如果您能從供應(yīng)商處獲得免費(fèi)的抗體樣品，將更容易選擇到合適的抗體。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法的特異性
許多實(shí)驗(yàn)需要使用抗體。在不同的方法中，由于樣品制備和目標(biāo)蛋白含量的差異，對(duì)于表位和抗體效價(jià)有不同的要求。
1.4 標(biāo)記的特異性
常見的實(shí)驗(yàn)，如WB和IHC，通常不需要標(biāo)記的一抗，而是使用標(biāo)記的二抗。然而，某些基于儀器分析的實(shí)驗(yàn)可能會(huì)使用標(biāo)記的一抗，例如流式細(xì)胞術(shù)（FC）。在這種情況下，需要了解所使用儀器可以檢測的熒光光譜，并根據(jù)不同的參數(shù)要求選擇合適的標(biāo)記。在免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)選擇和匹配不同的熒光標(biāo)記。
2. 抗體的選擇取決于實(shí)驗(yàn)/應(yīng)用
2.1 如何選擇WB抗體?
許多人建議使用單克隆抗體作為WB的一抗。目前，多克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)與單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)一樣成熟。因此，許多多克隆抗體在WB中也表現(xiàn)良好。除了一抗和二抗外，WB還涉及到負(fù)載控制抗體的使用，這有助于確認(rèn)整個(gè)凝膠中的蛋白質(zhì)負(fù)載是相同的。加載控制通常是在你所研究的細(xì)胞類型中高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)。最后但并非最不重要的是，無論你做什么實(shí)驗(yàn)，建議參考相關(guān)文獻(xiàn)來選擇合適的抗體。
圖2. Western Blot
2.2 如何選擇適用于IP/ChIP的抗體？
在免疫共沉淀（IP）中，抗體與目標(biāo)蛋白的自然形式結(jié)合。因此，適用于IP的最佳抗體是使用純化的自然蛋白或純化的重組蛋白制備的抗體。最好不要使用使用合成肽制備的抗體，因?yàn)檫@種抗體識(shí)別的區(qū)域可能深藏在目標(biāo)蛋白的內(nèi)部。
免疫沉淀（ChIP）與IP之間沒有太大區(qū)別。唯一的問題是，如果抗體識(shí)別的目標(biāo)蛋白區(qū)域與結(jié)合到DNA的目標(biāo)蛋白區(qū)域相同，實(shí)驗(yàn)可能會(huì)失敗。
2.3 如何選擇適用于IF/IHC的抗體？
在免疫熒光（IF）/免疫組化（IHC）中，有一個(gè)重要的步驟叫做固定，用于保留細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。固定會(huì)使蛋白質(zhì)變性和固定，意味著這些蛋白質(zhì)與其自然形式不同，但也不同于在免疫印跡（WB）中看到的線性結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)于IF/IHC，首選的抗體是使用純化的重組蛋白或使用蛋白質(zhì)表面的合成肽制備的抗體。
2.4 如何選擇適用于FC的抗體？
流式細(xì)胞術(shù)（FC）可以分為活細(xì)胞FC和固定細(xì)胞FC兩種類型。對(duì)于活細(xì)胞FC，最好選擇使用自然蛋白或重組蛋白制備的抗體；對(duì)于固定細(xì)胞FC，使用的抗體與IF/IHC中使用的抗體相同。在FC中，有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種方法。間接標(biāo)記相對(duì)于直接標(biāo)記來說準(zhǔn)確性較低。因此，在進(jìn)行FC時(shí)，最好選擇帶有熒光標(biāo)記的抗體；如果沒有針對(duì)目標(biāo)蛋白的標(biāo)記抗體，則可以選擇間接標(biāo)記，其中需要使用帶有熒光染料的二抗。
3. 主抗體和二抗的選擇
3.1 如何選擇一抗？
a. 確認(rèn)抗體的名稱。全名、縮寫、替代名稱、亞型等細(xì)節(jié)都需要考慮。
b. 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)/應(yīng)用的類型。ELISA、WB、IHC、ICC、FACS或其他？一般來說，抗體的產(chǎn)品說明書會(huì)列出該抗體在哪些應(yīng)用中經(jīng)過驗(yàn)證。如果抗體的產(chǎn)品說明書沒有提及特定的應(yīng)用，這并不意味著該抗體不適用于該應(yīng)用，只是表示該抗體在該應(yīng)用中沒有經(jīng)過驗(yàn)證。但一般而言，最好根據(jù)產(chǎn)品說明書中列出的驗(yàn)證信息選擇合適的抗體。
c. 確認(rèn)樣本的物種。人類、小鼠、大鼠、綿羊、魚類還是山羊？一般來說，抗體的產(chǎn)品說明書會(huì)包含物種反應(yīng)性的信息。有了這些信息，你可以確定該抗體是否適用于你的實(shí)驗(yàn)。
d. 目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)特性。了解目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)特性將有助于你選擇合適的抗體。這些結(jié)構(gòu)信息包括目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)域、樣本制備過程中蛋白質(zhì)是否變性、蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化以及可能影響免疫親和反應(yīng)的其他因素。
e. 單克隆抗體和多克隆抗體的選擇。市場上以多克隆抗體為主導(dǎo)。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有更高的特異性但親和力較低，從而導(dǎo)致相對(duì)較低的抗原檢測靈敏度。多克隆抗體具有較低的特異性但較高的親和力，因此其靈敏度更高。使用多克隆抗體可能會(huì)增加非特異性染色的風(fēng)險(xiǎn)，可以通過阻斷或其他步驟來避免這種情況。
圖1. 單克隆抗體與多克隆抗體的比較
3.2 如何選擇二抗?
a. 種類或來源。根據(jù)一抗的種類選擇二抗。例如，如果在小鼠體內(nèi)培養(yǎng)一抗，二抗就會(huì)對(duì)小鼠抗體產(chǎn)生反應(yīng)。
b. 標(biāo)簽的選擇。有不同的標(biāo)簽，如HRP，生物素和熒光素。SP三步法一般采用生物素標(biāo)記的二抗與SP反應(yīng)，熒光素染色采用羅丹明、FITC、Cy3等不同熒光素標(biāo)記的二抗體。
4. 常見問題解答
當(dāng)您購買抗體時(shí)，抗體供應(yīng)商/制造商通常會(huì)提供額外的技術(shù)支持，這非常重要。在過去，購買了我們公司Cusabio的抗體的一些客戶尋求了技術(shù)支持。以下是一些最常見的問題。
4.1 FC抗體與IHC抗體相同嗎?
它們不一定是相同的抗體。對(duì)于FC，有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。對(duì)于直接標(biāo)記，抗體通常是FITC, TRITC或pe標(biāo)記。如果你碰巧做免疫組化并且想要使用熒光素標(biāo)記的抗體直接標(biāo)記，那么你可以使用相同的抗體。如果你想在免疫組化中使用其他標(biāo)記或間接標(biāo)記，可能會(huì)遇到麻煩，因?yàn)闊晒馑貥?biāo)記可能會(huì)影響二抗與一抗的結(jié)合。
4.2 為什么我的抗體在WB中表現(xiàn)很好，但在其他實(shí)驗(yàn)如IF和IHC中卻不起作用?
首先，恭喜你有一個(gè)良好的抗體。畢竟，要獲得好的抗體并不容易。其次，你的抗體可能是用合成肽產(chǎn)生的。如上所述，你的抗體識(shí)別的抗原肽可能恰好隱藏在目標(biāo)蛋白的中心，所以你的抗體只能識(shí)別WB中的線性蛋白。
4.3 如何選擇用于免疫組織化學(xué)（IHC）的抗體？
首先，需要決定選擇單克隆抗體還是多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體的區(qū)別已經(jīng)在前面總結(jié)過。如果您的實(shí)驗(yàn)需要高特異性，單克隆抗體可能是更好的選擇。如果陽性信號(hào)較弱，可以嘗試多克隆抗體。多克隆抗體通常是從兔子中獲得的，而單克隆抗體通常是從小鼠中獲得的。當(dāng)然，還有其他動(dòng)物提供的抗體。
其次，了解主抗體可以與哪些物種反應(yīng)很重要。這些信息通常在抗體產(chǎn)品說明書中說明。
第三，您應(yīng)該注意主抗體的來源。例如，當(dāng)您在人類癌組織中進(jìn)行IHC檢測p53，并使用小鼠產(chǎn)生的抗-p53抗體作為主抗體時(shí)，您必須選擇抗小鼠的二抗，如山羊抗小鼠抗體和兔抗小鼠抗體。總之，主抗體和二抗應(yīng)匹配。
最后，抗體產(chǎn)品說明書通常包含抗體適用的應(yīng)用程序信息。如果說明書指出該抗體不能用于IHC，不要選擇它。即使說明書強(qiáng)調(diào)該抗體可用于IHC，也有一些情況下該抗體在IHC中效果不佳。自行驗(yàn)證抗體可以幫助您獲得成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4.4 WB次級(jí)抗體和IF次級(jí)抗體相同嗎？
顯然不相同！IF次級(jí)抗體用于免疫熒光試驗(yàn)，并且標(biāo)記有FITC、PE或其他能夠被紫外光激活的標(biāo)記物，信號(hào)通過熒光顯微鏡檢測。WB次級(jí)抗體通常標(biāo)記有HRP、堿性磷酸酶或其他能與顯色底物（如OPD\TMB）反應(yīng)的分子，結(jié)果可以直接用肉眼觀察或通過化學(xué)發(fā)光儀器檢測。
4.5 ChIP抗體能在WB中使用嗎？
不一定。一般來說，ChIP抗體對(duì)純度、特異性和其他參數(shù)有更高的要求。因此，ChIP抗體通常可以在WB中使用。然而，ChIP抗體識(shí)別的是構(gòu)象性抗原表位，而不是線性表位。這種類型的ChIP抗體不能在WB中使用。
4.6 如果抗體產(chǎn)品說明書中沒有提及特定的應(yīng)用程序怎么辦？
通常，抗體會(huì)在WB、IP、IF和IHC中進(jìn)行驗(yàn)證。因此，最好不要將抗體用于未在抗體產(chǎn)品說明書中提及的實(shí)驗(yàn)。
4.7 ELISA抗體可以用于WB嗎？
對(duì)于WB，抗體的稀釋倍數(shù)通常為1:1000；對(duì)于IF/IHC，為1:100；對(duì)于ELISA，為1:10000。如果一個(gè)抗體用于ELISA，通常意味著抗體效價(jià)不高。這并不意味著所有用于ELISA的抗體都不能用于WB。如果抗體產(chǎn)品說明書上說明ELISA的稀釋倍數(shù)為1:1000，那么可以嘗試1:100的稀釋倍數(shù)進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)。
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