無細胞蛋白表達與純化服務(wù)
無細胞蛋白表達系統(tǒng)又稱為體外翻譯系統(tǒng)。無細胞蛋白質(zhì)合成體系是以外源目的mRNA或DNA為模板，在細胞抽提物的酶系中通過人工添加蛋白質(zhì)合成所需的底物和能量，合成目的蛋白質(zhì)的體外蛋白合成系統(tǒng)。無細胞蛋白表達系統(tǒng)模擬生物細胞的生命現(xiàn)象，重現(xiàn)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯過程，它需要包含蛋白質(zhì)合成過程中所必需的各種原料、能量、轉(zhuǎn)錄因子和翻譯因子等。
該系統(tǒng)尤其適于膜蛋白和毒性蛋白的表達，同時具有周期短、通量高的特點。
該系統(tǒng)已有10多年歷史，但是技術(shù)難度較大。目前全球范圍內(nèi)，無細胞表達主要以Rothe、Promega等公司提供的試劑盒表達方案為主，條件單一，價格昂貴。華美生物是國內(nèi)第一批掌握大腸桿菌無細胞表達體系全套核心技術(shù)的公司，所有試劑均自配，核心組分均自產(chǎn)，反應體系含40余種成分，均可自由調(diào)整優(yōu)化。自2015年建立該平臺以來，已成功制備400多種蛋白，其中包含300多種傳統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)難以表達的1-15次跨膜蛋白和毒性蛋白，其中含有分子量高達130kDa-140kDa的多次跨膜蛋白。
系統(tǒng)優(yōu)勢
- 不受細胞結(jié)構(gòu)限制，可以表達對宿主細胞有毒的外源蛋白質(zhì)；
- 高通量，可以在多孔板上在各種不同條件下同時表達幾種不同的蛋白，適用于高通量蛋白質(zhì)組學研究；
- 開放式反應系統(tǒng)使反應條件易于更改，有助于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和后翻譯修飾；
- 允許添加非天然氨基酸或同位素標記的氨基酸來合成特殊用途的蛋白質(zhì)；
- 步驟少，實驗過程簡單，對設(shè)備依賴性較低。
服務(wù)優(yōu)勢
- 超高性價比，低至5500元起；
- 貨期短，20-25個工作日內(nèi)即可交付；
- 產(chǎn)量高，部分蛋白可以達到5mg/mL。
我們承諾
注：該無風險定制蛋白服務(wù)僅適用于800個氨基酸以內(nèi)的蛋白質(zhì)。如果您需要表達超過800個氨基酸的蛋白質(zhì)，我們將按步驟收費。
特色技術(shù)平臺
去污劑是同時具有親水極性基團和疏水非極性基團的雙極性分子，能夠使脂膜解體釋放膜蛋白，并在溶液中為去膜狀態(tài)下的膜蛋白提供疏水環(huán)境，維持膜蛋白的疏水跨膜結(jié)構(gòu)。
華美生物搭建了基于無細胞表達的去垢劑技術(shù)平臺。通過體外添加DNA模板、ATP、氨基酸、各種底物、細胞抽提物的酶等合成蛋白質(zhì)，篩選不同去垢劑來提取目的蛋白，可很好溶解純化跨膜蛋白，幫助其在溶液中形成天然正確構(gòu)象。
在含有去垢劑的緩沖液中，大部分膜蛋白可以維持穩(wěn)定性和活性。但少數(shù)對去垢劑敏感的膜蛋白是不適宜含有去垢劑的緩沖條件的，具體表現(xiàn)為無法純化，穩(wěn)定性不好和沒有活性。
華美生物搭建了基于無細胞表達的Nanodisc技術(shù)平臺。通過體外添加MSP，磷脂分子使其在反應過程中邊表達邊組裝成Nanodisc結(jié)構(gòu)，保持其生物學活性并有很好的水溶性。
服務(wù)內(nèi)容
| 步驟 | 服務(wù)項目 | 服務(wù)說明 | 華美生物特色 | 周期 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 質(zhì)粒構(gòu)建及制備
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密碼子優(yōu)化、全基因合成 | 多載體優(yōu)化 為了得到最高的表達量并且最低的序列修飾，除常規(guī)N端融合表達蛋白外，我們還提供N端短肽優(yōu)化表達服務(wù)。N端短肽包含6-11個氨基酸，可提高mRNA翻譯效率，從而提高蛋白產(chǎn)量。 |
6-9工作日 | |
| PCR擴增產(chǎn)物通過酶切連接到pET系列載體上 | |||||
| 重組質(zhì)粒大量制備 | |||||
| 2 | 小試表達及優(yōu)化
 |
多載體多反應條件優(yōu)化，SDS-PAGE電泳檢測，以確定最優(yōu)反應條件 | 多條件表達方案 無細胞表達能在多孔板上按照多種不同的條件，多種不同的蛋白同時平行進行。我們提供多條件優(yōu)化表達服務(wù)。 |
5-7工作日 | |
| 3 | 目標蛋白表達及純化
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根據(jù)小量結(jié)果提供1-10ml放大體系表達 | 6-9工作日 | ||
| 通過親和、離子交換及分子篩等多種層析方法純化目的蛋白 | 多條件純化方案（可選） 針對膜蛋白，我們提供不同去垢劑純化服務(wù)，以確保您的膜蛋白適合的最佳緩沖。活性膜蛋白最適合采用該優(yōu)化方案。 |
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| 4 | 其他（可選）服務(wù)
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收費 | 酶切去標簽服務(wù) | 靈活的附加服務(wù)（可選） 提供多種附加服務(wù)，客戶可根據(jù)實驗需求靈活選擇 |
3個工作日 |
| 免費 | 可提供無菌操作、內(nèi)毒素去除和凍干等服務(wù)（備注：凍干與無菌操作不可同時滿足） | 2個工作日 | |||
| 5 | 質(zhì)控
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進行純度、濃度等檢查，并提供QC報告 | 詳細的質(zhì)控報告 為每個項目提供產(chǎn)品說明書及完善的質(zhì)控報告 |
3-5工作日 | |
| 總時間 | 20-30工作日 | ||||
案例展示
案例1：無細胞表達系統(tǒng)表達多次跨膜蛋白
以下三個蛋白質(zhì)分別具有5、6和7個跨膜結(jié)構(gòu)域。由于在體內(nèi)表達系統(tǒng)中難以表達多次跨膜蛋白質(zhì)，或者產(chǎn)量非常低，華美生物使用無細胞表達系統(tǒng)來制備這三個蛋白質(zhì)。為了增加產(chǎn)量，我們嘗試了各種表達條件供客戶選擇。圖1、2和3分別展示了這三個蛋白質(zhì)在不同條件下的小規(guī)模表達情況，并選擇最佳條件進行大規(guī)模表達。
Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
Lane6: 反應條件6
Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
Lane6: 反應條件6
Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
Lane6: 反應條件6
案例2：無細胞表達系統(tǒng)表達大分子量高次跨膜蛋白
所展示案例為9次跨膜蛋白，分子量為141.7kDa。基于細胞的表達系統(tǒng)難以表達高次且大分子量跨膜蛋白。華美生物采用大腸無細胞表達系統(tǒng)成功表達，SDS-PAGE檢測肉眼可見。
Lane1:反應條件1
Lane2: 反應條件2
Lane3: 反應條件3
Lane4: 反應條件4
Lane5: 反應條件5
案例3：無細胞表達系統(tǒng)顯著提高蛋白表達量
這個項目的蛋白質(zhì)產(chǎn)量很低，華美生物采用無細胞表達系統(tǒng)，通過優(yōu)化不同的N-末端肽，產(chǎn)量顯著提高，如圖5所示。
Lane 1: 標簽 1
Lane 2: pET-28a(+) control
Lane 3: 標簽2
Lane 4: 標簽3
Lane 5: 標簽4
Lane 6: 標簽5
Lane 7: 標簽6
Lane 8: 標簽7
案例4：無細胞表達系統(tǒng)表達高活性膜蛋白
HTR1B為GPCR系列的膜蛋白，含有7次跨膜域。我們成功表達了該蛋白質(zhì)并進行了功能活性驗證，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)具有生物活性。
The Binding Activity of HTR1B (7TM) with GSTK1
Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized HTR1B at 5 μg/ml can bind human GSTK1, the EC50 of human GSTK1 protein is 159.40-218.50 ng/ml.
SLC7A11含有12次跨膜域。我們成功表達了該蛋白質(zhì)并進行了功能活性驗證，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)具有生物活性。
The Binding Activity of SLC7A11 with anti-SLC7A11 recombinant antibody
Activity: Measured by its binding ability in a functional ELISA. Immobilized human SLC7A11 at 2 μg/ml can bind anti-SLC7A11 recombinant antibody, the EC50 is 12.70-16.68ng/ml
案例5：無細胞表達系統(tǒng)使用不同去垢劑純化膜蛋白
圖1：FOS-12去垢劑純化7次跨膜蛋白
泳道1：蛋白1原樣
泳道2：穿透
泳道3-4：洗脫
泳道5：蛋白2原樣
泳道6：穿透
泳道7-8：洗脫
圖2：Brij-78去垢劑純化11次跨膜蛋白
泳道1-5：洗脫
泳道6：穿透
泳道7：原樣
聯(lián)系信息
電話：027-87002556
Q Q：1031906505 
地址：武漢市東湖新技術(shù)開發(fā)區(qū)高新大道818號高科醫(yī)療器械園B11號2樓
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武漢華美生物工程有限公司成立于2007年12月，是一家集科研、生產(chǎn)、銷售為一體的生物高新技術(shù)企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，遠銷歐美日德等九十多個國家。
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