ELISA試劑盒操作流程及技術要點
酶聯免疫吸附測定（ELISA）是指將可溶性的抗原或抗體結合到固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。
本講以雙抗體夾心法為例，詳細闡述ELISA的操作流程及技術要點，希望對科研朋友的實驗有所幫助。
1. 試劑配制
1.1 標準品
① 從試劑盒中取出一支標準品，于6000-10000rpm離心30秒。用1mL樣本稀釋液溶解，并用槍頭對準凍存管底部反復吸打5次以助溶解，充分混勻得到標準品S7，放置備用。
② 取7個1.5mL 離心管(S0-S6)依次排列，各加入250µL樣本稀釋液。吸取250µL 標準品S7到第一個離心管中(S6)，輕輕吹打混勻。從S6中吸取250µL到第二個EP管中(S5)，輕輕吹打混勻。以此類推進行標準品的倍比稀釋。S0為樣本稀釋液。
| 編號 | S7 | S6 | S5 | S4 | S3 | S2 | S1 | S0 |
| pg/mL | 2000 | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.25 | 0 |
1.2 洗液工作液
濃洗滌液按1:25倍用去離子水進行稀釋。例如用量筒量取240mL去離子水，倒入燒杯或其他潔凈容器中，再量取10mL濃洗滌液，均勻加入，攪拌混勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
1.3 生物素標記抗體工作液
生物素標記抗體液按1:100倍用生物素標記抗體稀釋液進行稀釋。如10μL生物素標記抗體加990μL生物素標記抗體稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10分鐘內配妥。
1.4 辣根過氧化物酶標記親和素工作液
辣根過氧化物酶標記親和素按1:100倍用辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液進行稀釋。如10μL辣根過氧化物酶標記親和素加990μL辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10分鐘內配妥。
2. 重要提示
2.1 實驗開始前，請提前配置好所有試劑。試劑或樣本稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。
2.2 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便管蓋和管壁上的液體集中到管底。
2.3 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
2.4 因實際裝量多于標示裝量，配制工作試劑請用精準的計量工具（移液槍或量筒等）量取，切勿不經量取直接使用。
2.5 標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制，實際配制時應多配制0.1-0.4mL。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。
2.6 標準品的稀釋請勿于板中進行，標準品應于臨用前15分鐘內配制。為保證實驗有效性，建議每次實驗使用新的標準品。若保存得當，溶解后的標準品S7可在2-8℃保存，7天內使用有效。
3. 操作步驟
3.1 將各種試劑移至室溫（18-25℃）平衡至少30分鐘，按前述方法配制試劑，備用。
3.2 加樣：分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育2小時
3.3 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.4 每孔加生物素標記抗體工作液100μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時。
3.5 棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200μL/每孔，甩干。
3.6 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時。
3.7 棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200μL/每孔，甩干。
3.8 依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色15-30分鐘。
3.9 依序每孔加終止溶液50μL，終止反應。
3.10 在反應終止后5分鐘內用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
4. 操作要點
4.1 為保證檢測結果的準確性，建議標準品及樣本均設雙孔測定。每次檢測均需做標準曲線。
4.2 如標本中待測物質含量過高，請先用樣本稀釋液進行稀釋，以使樣本符合試劑盒的檢測范圍，最后計算時再乘以相應的稀釋倍數。
4.3 加樣：加樣時，請使用一次性的潔凈吸頭，避免交叉污染。加樣時應盡量輕緩，避免起泡，將樣本加于酶標板孔底部，切勿沿孔壁加樣。一次加樣時間最好控制在10分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4.4 溫育：為防止樣本蒸發或污染，溫育過程中酶標板必須覆上板貼，實驗過程中酶標板應避免處于干燥的狀態。溫育過程中應隨時觀察溫箱溫度是否恒定于37℃，及時調整。溫育過程中，溫箱不易開啟太多次，以免影響溫度平衡。
4.5 洗滌：洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
● 手工洗板方法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液按200μL/孔注入孔內，浸泡2分鐘。根據操作步驟中所述，重復此過程數次。
● 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
4.6 顯色：為保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液?？稍诩尤氲孜锶芤汉竺扛粢欢螘r間觀察一下顯色情況以控制反應時間（比如每隔10分鐘）。當肉眼可見標準品前3-4孔有明顯梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯時，即可加入終止液終止反應，此時藍色立刻變為黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
4.7 底物溶液應為淺藍色或無色，如果顏色嚴重變深則必須棄用。底物溶液易受污染，請避光妥善保存。
