文獻(xiàn)解讀│CUSABIO產(chǎn)品榮登Nature Medicine：潰瘍性結(jié)腸炎中結(jié)腸CD8 + T細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜

日期：2020-09-17 11:29:59

研究背景及目的

結(jié)腸內(nèi)抗原接觸的淋巴細(xì)胞（如組織駐留記憶CD8+T細(xì)胞）可對(duì)重復(fù)的抗原暴露迅速做出反應(yīng)。但是，這些CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞表型及其驅(qū)動(dòng)免疫調(diào)節(jié)和炎癥的機(jī)制仍不清楚。用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與T細(xì)胞受體庫(kù)分析和質(zhì)譜分析技術(shù)，研究人員繪制了健康和潰瘍性結(jié)腸炎（UC）中人結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞圖譜，確定健康和UC中的結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞表型，定義不同細(xì)胞亞群之間的克隆關(guān)系，表征UC中表達(dá)IL-26的功能缺陷的終末分化CD8+ T細(xì)胞。

結(jié)論

CD8+ T細(xì)胞組成存在廣泛的異質(zhì)性，包括擴(kuò)增的效應(yīng)子和“后效應(yīng)子”終末分化的CD8+ T細(xì)胞。UC相關(guān)的CD8+效應(yīng)細(xì)胞可以觸發(fā)腸道損傷并產(chǎn)生腫瘤壞死因子TNF-α，而后效應(yīng)細(xì)胞的先天特征，可能有助于后效應(yīng)細(xì)胞獲得調(diào)節(jié)功能來(lái)減輕過(guò)度的炎癥反應(yīng)。在急性炎癥反應(yīng)中IL26具有保護(hù)作用。

結(jié)果

1.結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，UC患者的結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞組成存在結(jié)構(gòu)性變化，UC改變CD8+細(xì)胞與上皮細(xì)胞的交互應(yīng)答

利用單細(xì)胞測(cè)序比較健康志愿者及UC結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜，利用UMAP算法將CD8+ T細(xì)胞分為14個(gè)細(xì)胞亞群。GO富集和基因表達(dá)豐度分析顯示CD8+CD4+亞群具有IL-17通路活性，而IEL和IL26+細(xì)胞具有NK通路活性，說(shuō)明結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞具有廣泛異質(zhì)性。與健康細(xì)胞相比，UC結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞中，TRM細(xì)胞比例顯著減少，GZMK+效應(yīng)細(xì)胞及IL26+細(xì)胞比例顯著增加。此外，UC中 CD4+CD8+FOXP3+亞群增多，先天TYROBP+ IEL亞群減少，擴(kuò)增的TYROBP- IEL亞群誘導(dǎo)增多。多數(shù)差異基因只存在于一種亞群中，有34個(gè)基因在四個(gè)以上的亞群中差異表達(dá)，這些基因包括在TRM、效應(yīng)細(xì)胞和IEL細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)的SPINK2、FOS、CD160和上調(diào)表達(dá)的TNFRSF9和CTLA4，反映出炎癥性腸病（IBD）形成過(guò)程中效應(yīng)細(xì)胞具有不同的通路活性。利用轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)腸內(nèi)IBD遺傳易感位點(diǎn)分析顯示，UC相關(guān)位點(diǎn)的GWAS基因在14個(gè)亞群中高度富集，富集程度最高的是TYROBP- IEL和IL26+細(xì)胞。

依據(jù)差異表達(dá)的受體和配體對(duì)，研究人員在UC中共鑒定到1716個(gè)交互作用的改變。UC結(jié)腸細(xì)胞中HLA-E在多個(gè)上皮細(xì)胞亞群中上調(diào)，對(duì)應(yīng)的配體在CD8+ T細(xì)胞中上調(diào)。譜系特異性相互作用包括IL18-IL18R1/IL18RAP和TNF-TNFRSF1A信號(hào)分子在吸收細(xì)胞和CD8+細(xì)胞亞群中線性表達(dá)。雖然IL-26在所有組織都表達(dá)且與炎癥反應(yīng)程度正相關(guān)，IL-26受體IL10RB/IL20RA在上皮細(xì)胞、間葉細(xì)胞、免疫細(xì)胞中均表達(dá)較低，說(shuō)明IL-26在UC中的高表達(dá)并不是由其受體造成的。

2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主導(dǎo)UC結(jié)腸CD8+細(xì)胞的可塑性，TCR profiling揭示不同CD8+細(xì)胞亞群之間的聯(lián)系

基因共表達(dá)分析共鑒定到273個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)的基因表達(dá)模塊。EGR1和EGR2所在的一類基因模塊，它們的活性處于TRM向GZMK+效應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)換的區(qū)域，與炎癥因子IFNG、TNF和早期反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子共表達(dá)，暗示CD8+ T結(jié)腸細(xì)胞中，分泌EGR的T細(xì)胞能迅速被激活并對(duì)大多數(shù)致病性TNF做出反應(yīng)的機(jī)制。

UC中富集的GZMK+效應(yīng)細(xì)胞和IL26+細(xì)胞具有T細(xì)胞耗竭的特征，標(biāo)志著CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)。這種現(xiàn)象表征為共抑制分子HAVCR2、LAYN、ENTPD1、CTLA4、PDCD1和轉(zhuǎn)錄因子TOX和EOMES一致性表達(dá)，說(shuō)明UC中IL26+ CD8+細(xì)胞具有慢性激活的特性。

仿時(shí)間分析將時(shí)間共變基因分為早期、中期/中晚期、晚期表達(dá)基因。Na?ve細(xì)胞和早期中央記憶T細(xì)胞的標(biāo)記分子（如CCR7）早期表達(dá)，共抑制受體（HAVCR2，CTLA4）較晚表達(dá)。TCR profiling分析揭示，UC中，未擴(kuò)增的細(xì)胞在仿時(shí)間軌跡的起點(diǎn)富集，而大部分?jǐn)U增的T細(xì)胞克隆在仿時(shí)間軌跡的終點(diǎn)富集。

3.UC中獲得性IL26+細(xì)胞顯示先天性特征

單細(xì)胞譜鑒定到包括MAIT細(xì)胞和γδ IELs在內(nèi)的先天CD8+淋巴細(xì)胞簇。雖然MAIT細(xì)胞幾乎沒(méi)有異質(zhì)性，但在UC中，它們活化程序與常規(guī)CD8 +細(xì)胞類似，包括早期反應(yīng)基因EGR1和EGR2與TNF和IFNG的共表達(dá)，以及以共抑制分子和共刺激分子表達(dá)為表征的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換。Vδ1 γδ細(xì)胞在CD8+ IEL亞群中占有很高比例，但TCR-αβ細(xì)胞也大量表達(dá)先天免疫細(xì)胞標(biāo)志分子，例如殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）（如KIR2DL4和KIR2DL2），NK細(xì)胞受體（如NCR1）和FCER1G。研究人員發(fā)現(xiàn)MKI67+細(xì)胞表達(dá)了部分以上基因，說(shuō)明UC中IEL亞群正在獲得增殖活性。通過(guò)結(jié)腸上皮細(xì)胞scRNA-seq研究捕獲的T細(xì)胞種群富集有IEL細(xì)胞，研究人員對(duì)先天性IEL細(xì)胞進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞大部分是CD8+細(xì)胞，僅存在少量CD4+細(xì)胞。基于TYROBP的表達(dá)將IEL細(xì)胞分為自然型和誘導(dǎo)型IEL細(xì)胞，UC中觀察到IEL細(xì)胞存在向誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)變的偏好。研究人員還發(fā)現(xiàn)在UC中增多的獲得性CD8+ IL26+細(xì)胞也顯示出不同于IEL轉(zhuǎn)錄譜的先天性特征，IL26+細(xì)胞缺少KLRC2和IEL特異性KIRs標(biāo)記分子，確表達(dá)譜系陰性先天性淋巴細(xì)胞2型ILC3的標(biāo)記分子和轉(zhuǎn)錄因子。這些結(jié)果表明CD8+ IL26+細(xì)胞雖然譜系陽(yáng)性確具有雜合型Tc17和2型ILC3細(xì)胞的特性。

4.多組學(xué)分析證實(shí)UC中CD8+ T細(xì)胞異質(zhì)性和重塑

研究人員利用CITE-seq結(jié)合cell hashing技術(shù)證實(shí)scRNA-seq中CD8+ T細(xì)胞亞群分類的可靠性，證實(shí)了不同亞群之間組織駐留與遷移偏好的差異，并利用ELISA證實(shí)IL-26蛋白在UC結(jié)腸CD8+ T細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)。

5.多維度分析UC中CD8+細(xì)胞亞群功能

利用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，研究人員將39個(gè)標(biāo)記分子整合到scRNA-seq的細(xì)胞分類中，將CD8+ T細(xì)胞細(xì)分為19個(gè)亞群。體外細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD8+ T細(xì)胞活化后，表達(dá)TNF-α和IFN-γ的CD103+ TRM細(xì)胞亞群在健康和UC結(jié)腸細(xì)胞中均開始富集，而GZMK+效應(yīng)細(xì)胞只在UC結(jié)腸細(xì)胞中富集。很少有IL23R+細(xì)胞（主要包括IL26+，一些MAIT和DP細(xì)胞）對(duì)PMA+ionomycin刺激作出反應(yīng)，符合其轉(zhuǎn)錄的“后效應(yīng)子”終末分化特征。IL-17在UC IL23R+/IL26+細(xì)胞中低表達(dá)，但UC CD8+細(xì)胞的激活能誘導(dǎo)IL-17在缺失IL23R但TNF-α/IFN-γ陽(yáng)性的亞群中表達(dá)。

6.人源化小鼠模型中，人IL-26的表達(dá)可緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，IL-26抗體處理可逆轉(zhuǎn)

利用DSS處理小鼠，相比野生型小鼠，用對(duì)照單抗處理過(guò)的hIL-26Tg小鼠的炎癥指標(biāo)顯著降低，而用IL-26單抗處理可使炎癥指標(biāo)回升，暗示IL-26在急性炎癥反應(yīng)中具有保護(hù)作用。對(duì)小鼠的健康結(jié)腸組織和經(jīng)DSS處理過(guò)的結(jié)腸組織進(jìn)行RNA-seq，GO富集分析表明野生小鼠中與T細(xì)胞和B細(xì)胞活化以及白細(xì)胞增殖相關(guān)的基因富集，而Tg小鼠中富集程度明顯降低，說(shuō)明即使在非炎性條件下，IL26也能降低粘膜的免疫浸潤(rùn)或下調(diào)激活和增殖信號(hào)。經(jīng)DSS處理過(guò)的小鼠中，炎癥信號(hào)分子在hIL-26小鼠中顯著下調(diào)。