實時PCR的可靠性？（上）

日期：2012-05-10 08:26:54

兩個人完成同樣的實時PCR（real-time PCR）實驗有可能得到不同的結(jié)果。研究人員正在量化這一差異性以了解它的來源以及如何解決這一問題。

當(dāng)一個細胞中某個基因的表達增高時，首先衡量的可以是基因與它的最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的中間分子——信使RNA（mRNA）。對于希望基于健康、環(huán)境或內(nèi)部線索對細胞進行追蹤的科學(xué)家們而言，測量mRNA分子的改變是一種追蹤細胞基因上調(diào)、下調(diào)、開啟或關(guān)閉的最好的途徑。

自從20世紀90年代中期以來，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)即成為了追蹤單細胞中mRNA分子濃度的常用方法。然而RT-qPCR的每一步都可能將錯誤引入到實驗中。現(xiàn)在，一些科學(xué)家們正試圖退后一步觀察如何能夠通過優(yōu)化將RT-qPCR應(yīng)用于研究領(lǐng)域，來改善他們的研究數(shù)據(jù)。

葡萄牙米尼奧大學(xué)微生物學(xué)家Nuno Cerca 說。“當(dāng)前有大量的研究工作針對標(biāo)準化qPCR方法。然而我認為它仍被低估了。盡管遵循標(biāo)準化指南，我們可以獲得重現(xiàn)性好的研究結(jié)果，但它們并不可靠。”

Cerca提到的現(xiàn)有指南是指MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments），簡稱mykee，是一套在國際上最新推出的指導(dǎo)方針，就評價qPCR實驗和發(fā)表文章時所必需的實驗信息提出了最低限度的標(biāo)準。這些指南首次由倫敦大學(xué)瑪麗皇后學(xué)院的分子生物學(xué)家Stephen Bustin領(lǐng)導(dǎo)的研究小組于2009年發(fā)布在《臨床化學(xué)》雜志（journal Clinical Chemistry）上。該指南提出了研究人員應(yīng)該納入到他們的qPCR實驗中的一些細節(jié)以確保獲得準確的結(jié)果。它們被分為四個關(guān)鍵領(lǐng)域：樣本質(zhì)量控制、實驗設(shè)計、PCR效率和標(biāo)準化。

“在同行評審的文獻中MIQE指南現(xiàn)已被引用超過600次，成為了《臨床化學(xué)》發(fā)表的論文中引用排名第八的文章。因此這一信息已經(jīng)開始傳播至整個研究群體，”Bustin說。

然而有一些研究人員卻并沒有審核MIQE推薦的優(yōu)化步驟繼續(xù)開展qPCR實驗，并公布他們的研究結(jié)果。“我認為這些人并不是不知道這一指南，只不過為了所謂的方便不想遵循它們而已，”加拿大國立科學(xué)研究所（INRS）Armand－Frappier 研究所的Cathy Vaillancourt說。

回歸基礎(chǔ)

在加拿大國立科學(xué)研究所的實驗室中，Vaillancourt研究了健康孕婦與患有妊娠糖尿病或先兆子癇孕婦的胎盤差異。為了了解這些疾病，Vaillancourt和她的同事們觀察了在不同胎盤中基因表達水平的差異。她們依賴RT-qPCR來定量指定目的基因生成的mRNA量。

去年，Vaillancourt開始利用新型的Bio-Rad實時PCR儀開展一系列的RT-qPCR 實驗。然而當(dāng)她的兩個學(xué)生從事相同的實驗時，他們得到了不同的實驗結(jié)果。因此，她開始去了解是什么將差異引入了RT-qPCR實驗中以及研究人員如何能解決這一問題。她很快確定參考基因是她的研究團隊差異性的主要來源。