實時PCR的可靠性？（下）
日期：2012-05-10 08:27:18
兩個人完成同樣的實時PCR（real-time PCR）實驗有可能得到不同的結果。研究人員正在量化這一差異性以了解它的來源以及如何解決這一問題。
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Vaillancourt 說：“胎盤有大量的RNA降解酶，在樣本被分離出來以前許多的mRNA有可能被降解。”事實是像糖尿病和先兆子癇這類可以引起廣泛遺傳改變的疾病，甚至也有可能改變了參考基因的水平，這使得Vaillancourt開始猜想她們選擇的參考基因將大量的錯誤引入到了研究小組RT-qPCR實驗中。
Vaillancourt回歸到基礎，她并沒有理所當然地將常用的參考基因作為她研究工作的最佳選擇，而是利用兩個計算機程序分析了參考基因的穩定性，計算出最穩定的，能夠在健康和疾病胎盤樣本中維持最一致水平的參考基因。這是MIQE推薦的一個步驟，但是Vaillancort之前并沒有人這樣做。
她的研究發現遠遠超出了她預期的結果。當她將選擇的一個參考基因與另一個比較時，樣本間基因水平差異如此之大，可完全逆轉單個目的基因中觀察到的趨勢。
“用一個參考基因會使目的基因看起來表達增高，而用另一個參考基因則使其看起來表達降低，”她說。
她的研究團隊得到的教訓是在qPCR實驗中參考基因的選擇非常重要。Vaillancourt 說：“現在，我們每次做實驗時都要做到這一點。我們會一直嘗試為特異實驗尋找最好的參考基因——這些基因在我們研究的組織間具有最小的差異。”
試劑盒vs.試劑盒
在葡萄牙米尼奧大學Cerca的實驗室中，問題并不在于參考基因，而是選擇最適合研究的RNA抽提試劑盒。Cerca研究的是附著在固體表面生長的細菌形成的生物膜。Cerca發現從大腸桿菌中抽提出RNA相對容易，然而當他試圖從其他類型生物體的生物膜中抽提出RNA時，開始出現了問題。一些RNA抽提試劑盒似乎無法良好地發揮作用。
Cerca 說：“曾經有一些文獻描述不同的RNA試劑盒會生成不同質量的RNA。然而，不同質量的RNA并不一定意味著我們會獲得不同的基因表達結果。最終，且最重要的問題是：什么試劑盒可以讓我們以盡可能最低的價格獲得可靠且有意義的結果？”
Cerca研究小組著手比較了五個商業化RNA抽提試劑盒用于三種不同的食物傳播形成生物膜的細菌。他們在每個試劑盒中采用的是完全相同的樣本，運行RT-qPCR試驗來量化來自每個抽提試劑盒的RNA。盡管利用試劑盒獲得RNA產量和純度沒有對RT-qPCR試驗產生影響，然而RNA的完整性（即RNA降解程度）卻影響了實驗結果，在不同試劑盒間存在差異。
“我不得不承認我對我們獲得的一些結果感到驚訝：在某些情況下，RNA濃度降低3倍，卻存在超過10倍的差異基因表達，”Cerca說。
他的研究小組找到了最好的試劑盒，這一試劑盒最適合于生物膜研究。但它并不一定對每個人都是最佳的。通過比較實踐是關鍵。對于每個研究人員而言，鑒別他們的qPCR實驗哪些方面需要優化非常重要。
MIQE 指南的倡導者Bustin現在正致力推動對希望學習實時PCR或希望改善實驗結果的研究人員給予更全面的培訓。他已經開發了一系列的iBooks，讓科學家們通過幾個步驟來優化qPCR實驗。
“一個精心設計的實驗與另一個針對同一目標的精心設計的實驗不會有太大的差異。但是兩個粗陋設計的實驗就會生成不同的結果，”Bustin說。
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