如何表達具有生物活性的蛋白質？
日期：2024-01-26 10:25:19
蛋白質生產--生產特定蛋白質的過程--已成為生物和生物醫學科學中一項極其重要的生物技術。在大多數情況下，相關蛋白質在體內具有某種形式的生物活性。根據所生產蛋白質的用途，我們可能會對其生物活性提出不同的要求。但如何才能確保生產的蛋白質具有生物活性呢？本文將重點討論這個問題，并提供一些解決方案。
首先，需要選擇合適的表達系統。
經過多年的發展，已經出現了多種表達系統，通常可分為細胞表達系統和無細胞表達系統。基于細胞的系統可分為細菌系統（包括大腸桿菌、棒狀桿菌和熒光假單胞菌）和真核系統（包括酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia Pastoris）、絲狀真菌、桿狀病毒感染細胞、非溶解性昆蟲細胞表達、利什曼菌和哺乳動物系統）。從這么多不同的表達系統中選擇一種合適的系統有些困難，因為不同的表達系統可能有不同的特點。例如，大腸桿菌是一種原核生物，缺乏糖基化修飾等翻譯后修飾機制，因此通常不適合表達復雜的真核蛋白質。
請訪問此處閱讀表格，進一步了解五種常用表達系統的優勢和應用。它將幫助您選擇合適的表達系統。
其次，需要選擇合適的載體。
載體是一種 DNA 分子，可幫助將外來遺傳物質輸送到另一個細胞中，并在其中復制和/或表達。克隆載體是一種有用的方法，可以產生許多感興趣基因的拷貝。表達載體會影響基因在目標生物體內轉化為 mRNA 和蛋白質的實際表達。在質粒、病毒載體、cosmids 和人工染色體這四種主要載體中，質粒最常用。有一系列可用的質粒載體，但如何選擇最佳載體呢？影響載體選擇的因素有很多，如插入大小、拷貝數、不相容性、可選擇標記、克隆位點和專門的載體功能等。以下是常用載體表。
表1 華美生物常用載體
在選擇矢量時，您最好考慮這些因素：
① 插入片段的大小
這里唯一需要考慮的是你要克隆的是大DNA片段還是小DNA片段。為了操作方便，載體必須是相對較小的分子。過大的載體可能會影響復制并導致穩定性問題。通常，質粒可以處理長達 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質粒可以處理更大的插入物。
② 可選擇標記
需要選擇性標記。標記可用于識別陽性轉化子。可選擇標記主要有兩類：抗藥性標記（包含一種能使特定抗生素失活的酶的編碼基因）和輔助營養標記（能使帶有標記的細胞在沒有培養基中必需營養物質的情況下存活）。
③ 限制位點
必須有多個方便的限制性位點，用于插入要克隆的 DNA。
④ 拷貝數
一般來說，高拷貝數的質粒載體更好。但在某些情況下，需要低拷貝載體，因為高拷貝質粒可能會導致毒性等問題。
第三，需要選擇適當的純化方法。
對于某些應用，粗提取物就足夠了。但對于其他用途，則需要高純度。要生產出高純度的蛋白質，就必須對所生產的蛋白質進行純化。蛋白質純化是指從細胞、組織或整個生物體中分離出一種或多種蛋白質的過程。目前已開發出多種純化策略，如尺寸排阻色譜法（SEC）、基于電荷或疏水性的分離法、親和色譜法（AC）和高效液相色譜法（HPLC）。
第四，驗證實驗很重要。
要確認所生產蛋白質的生物活性，通常需要進行驗證實驗。應測量折疊、修飾和活性。重組蛋白的生物活性通常是通過酶聯免疫吸附試驗等生物檢測方法來測定的。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和西部印跡法（WB）是檢測復雜混合物中特定蛋白質的兩種最有效的方法。
ELISA 是一種利用抗體和顏色變化來識別具有抗原特性的物質（如蛋白質、激素、細菌抗原和抗體）的方法。ELISA 檢測通常具有高度靈敏性和特異性。
WB 是一種根據蛋白質與特定抗體結合的能力來識別和定位蛋白質的技術。它可以提供有關蛋白質大小的信息（與以 kDa 為單位的大小標記或梯子進行比較），還可以提供有關蛋白質表達的信息（與對照組進行比較，如未經處理的樣本或其他細胞類型或組織）。
總之，表達具有生物活性的重組蛋白是一個復雜的過程，需要考慮很多方面。作為生產商，Cusabio 可提供蛋白質表達服務，幫助您開展研究。有關華美生物蛋白服務的更多詳情，請訪問 http://www.tzmingka.cn/protein_service/。
首先，需要選擇合適的表達系統。
經過多年的發展，已經出現了多種表達系統，通常可分為細胞表達系統和無細胞表達系統。基于細胞的系統可分為細菌系統（包括大腸桿菌、棒狀桿菌和熒光假單胞菌）和真核系統（包括酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia Pastoris）、絲狀真菌、桿狀病毒感染細胞、非溶解性昆蟲細胞表達、利什曼菌和哺乳動物系統）。從這么多不同的表達系統中選擇一種合適的系統有些困難，因為不同的表達系統可能有不同的特點。例如，大腸桿菌是一種原核生物，缺乏糖基化修飾等翻譯后修飾機制，因此通常不適合表達復雜的真核蛋白質。
請訪問此處閱讀表格，進一步了解五種常用表達系統的優勢和應用。它將幫助您選擇合適的表達系統。
其次，需要選擇合適的載體。
載體是一種 DNA 分子，可幫助將外來遺傳物質輸送到另一個細胞中，并在其中復制和/或表達。克隆載體是一種有用的方法，可以產生許多感興趣基因的拷貝。表達載體會影響基因在目標生物體內轉化為 mRNA 和蛋白質的實際表達。在質粒、病毒載體、cosmids 和人工染色體這四種主要載體中，質粒最常用。有一系列可用的質粒載體，但如何選擇最佳載體呢？影響載體選擇的因素有很多，如插入大小、拷貝數、不相容性、可選擇標記、克隆位點和專門的載體功能等。以下是常用載體表。
表1 華美生物常用載體
| 表達系統 | 載體 | 標簽 |
| 大腸桿菌表達系統 | pGEX-6p-1 | N-terminal GST-tagged |
| pGEX-4T-1 | N-terminal GST-tagged | |
| pGEX-4T-2 | N-terminal GST-tagged | |
| pET21a(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET21b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET22b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-23b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-26b(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET28a(+) | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-29a(+) | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET30a(+) | N-terminal 6xHis-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET32a(+) | N-terminal 6xHis-Trx-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pET-43.1a(+) | N-terminal 6xHis-NusA-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pMal-c2X | N-terminal MBP-tagged | |
| pColdIII | NO-tagged | |
| pBV220 | NO-tagged | |
| pACYCDuet-1 | N-terminal 6xHis-tagged | |
| pETDuet-1 | N-terminal 6xHis-tagged | |
| 酵母表達系統 | pPIC9K | NO-tagged |
| pPIC3.5K | NO-tagged | |
| pPICZα A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pGAPZα A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pPICZ A | C-terminal Myc-tagged and C-terminal 6xHis-tagged | |
| pPinkα-HC | NO-tagged | |
| pPinkα-LC | NO-tagged | |
| 哺乳動物細胞表達系統 | pCMV6-Entry | C-terminal Flag-tagged |
| pSecTag2A | C-terminal 6xHis-tagged | |
| pTT5 | NO-tagged | |
| 昆蟲-桿狀病毒表達系統 | pFastBac 1 | NO-tagged |
| pFastBac HTB | N-terminal 6xHis-tagged | |
| pFastBac Dual | NO-tagged | |
| 無細胞表達系統 | pET21a | N-10xHis tag |
| pET28a-sumo | N-10xHis tag-sumo tag | |
| pET23b | C-6xHis tag |
在選擇矢量時，您最好考慮這些因素：
① 插入片段的大小
這里唯一需要考慮的是你要克隆的是大DNA片段還是小DNA片段。為了操作方便，載體必須是相對較小的分子。過大的載體可能會影響復制并導致穩定性問題。通常，質粒可以處理長達 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質粒可以處理更大的插入物。
② 可選擇標記
需要選擇性標記。標記可用于識別陽性轉化子。可選擇標記主要有兩類：抗藥性標記（包含一種能使特定抗生素失活的酶的編碼基因）和輔助營養標記（能使帶有標記的細胞在沒有培養基中必需營養物質的情況下存活）。
③ 限制位點
必須有多個方便的限制性位點，用于插入要克隆的 DNA。
④ 拷貝數
一般來說，高拷貝數的質粒載體更好。但在某些情況下，需要低拷貝載體，因為高拷貝質粒可能會導致毒性等問題。
第三，需要選擇適當的純化方法。
對于某些應用，粗提取物就足夠了。但對于其他用途，則需要高純度。要生產出高純度的蛋白質，就必須對所生產的蛋白質進行純化。蛋白質純化是指從細胞、組織或整個生物體中分離出一種或多種蛋白質的過程。目前已開發出多種純化策略，如尺寸排阻色譜法（SEC）、基于電荷或疏水性的分離法、親和色譜法（AC）和高效液相色譜法（HPLC）。
第四，驗證實驗很重要。
要確認所生產蛋白質的生物活性，通常需要進行驗證實驗。應測量折疊、修飾和活性。重組蛋白的生物活性通常是通過酶聯免疫吸附試驗等生物檢測方法來測定的。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和西部印跡法（WB）是檢測復雜混合物中特定蛋白質的兩種最有效的方法。
ELISA 是一種利用抗體和顏色變化來識別具有抗原特性的物質（如蛋白質、激素、細菌抗原和抗體）的方法。ELISA 檢測通常具有高度靈敏性和特異性。
WB 是一種根據蛋白質與特定抗體結合的能力來識別和定位蛋白質的技術。它可以提供有關蛋白質大小的信息（與以 kDa 為單位的大小標記或梯子進行比較），還可以提供有關蛋白質表達的信息（與對照組進行比較，如未經處理的樣本或其他細胞類型或組織）。
總之，表達具有生物活性的重組蛋白是一個復雜的過程，需要考慮很多方面。作為生產商，Cusabio 可提供蛋白質表達服務，幫助您開展研究。有關華美生物蛋白服務的更多詳情，請訪問 http://www.tzmingka.cn/protein_service/。
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