如何選擇合適的表達載體？

日期：2024-01-26 10:23:07

在生物醫學研究和許多其他領域，對重組蛋白的需求日益增長。要生產重組蛋白質，需要將蛋白質編碼序列克隆到合適的表達載體中，然后轉化到宿主細胞中。那么，表達載體究竟是什么呢？
簡單地說，表達載體是一種 DNA 分子，它攜帶特定基因進入宿主細胞，并利用細胞的蛋白質合成機制來生產基因編碼的蛋白質。表達載體允許外來基因在宿主細胞中高水平表達，經過多年的發展，表達載體已成為一種成熟和流行的生物技術。
  由于其功能，表達載體必須包含基因表達所必需的元素。眾所周知的元素包括強啟動子或正常啟動子、正確的翻譯啟動序列（如核糖體結合位點（RBS）和啟動密碼子）、終止密碼子和轉錄終止序列。此外，為了便于蛋白質生產后的純化，表達載體通常帶有純化標簽，將其添加到所需的蛋白質序列中。最后，有些表達載體還帶有一些特殊的元素，例如對轉化或轉染至關重要的元素。
  說到表達載體，就不得不提到克隆載體。從本質上講，表達載體和克隆載體都是獨立于染色體的人工構建的環狀 DNA 序列。通常，表達載體比克隆載體更復雜。克隆載體是指一種 DNA 分子，它能將外來 DNA 帶入宿主細胞，在細胞中復制并產生目標基因的多個拷貝。克隆載體包含自我復制的關鍵元件，但不攜帶蛋白質表達調控元件。相比之下，表達載體則同時包含這兩種元素。
  目前，有多種蛋白質表達系統可供選擇，如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。因此，有許多不同的表達載體可用于不同的表達系統。最常見的表達載體是質粒和病毒。決定使用哪種載體取決于表達系統和許多其他因素。合適的表達載體有助于目標蛋白質的成功表達，必要時還有助于蛋白質的純化。

在選擇表達載體時，最好牢記以下幾點：

1. 表達系統
  你需要選擇一種表達系統專用的表達載體。在選擇表達載體之前，你應該決定用哪種系統來表達你感興趣的蛋白質。

圖 1 用于大腸桿菌表達系統的表達載體 pET22b-JT

圖 2 用于酵母表達系統的表達載體 pPic9k-JT

2. 純化標簽
  如果想在表達后純化蛋白質，表達載體可能會包含純化標簽，如 His、Myc、FLAG 等。無論如何，是否需要 C 端或 N 端標簽取決于實驗的具體需要。

3. 目標蛋白的應用
  根據目標蛋白的下游應用，表達載體可能含有其他標簽和融合蛋白。有時，特定的標簽有助于研究目標蛋白的功能和蛋白與蛋白之間的相互作用。如果您想進一步了解目標蛋白的功能，標簽和融合蛋白是有用的工具，可以讓您進行 Western 印跡、免疫沉淀、pull-down 分析（體外蛋白結合分析）或其他實驗。

4. 啟動子的強度
  啟動子是 DNA 分子上與 RNA 聚合酶特異性結合并形成轉錄起始復合物的區域，轉錄起始復合物可啟動下游基因的轉錄。啟動子就像 "開關 "一樣，決定基因的活性，控制基因表達的啟動和程度。因此，啟動子是構建表達載體的必要條件。
  在某些情況下，需要強啟動子，而在另一些情況下，則需要普通啟動子。例如，在酵母中，TEF1 是強組成型啟動子，ADH1 是中等強度的組成型啟動子，STE1 是弱組成型啟動子。適當的啟動子強度足以讓產物在宿主細胞內大量積累，并能最大限度地減少對細胞生長的任何不利影響，如毒性。

5. 可選擇標記
  可選擇標記是一種基因，它能賦予含有目標基因（重組載體）的宿主細胞一種適合人工選擇的性狀。簡而言之，可選擇標記基因有助于識別和篩選陽性轉化子（接受重組載體的細胞）。可選擇標記的選擇取決于你使用的宿主細胞類型。可選擇標記通常是抗生素抗性基因。例如，β-內酰胺酶賦予細菌宿主氨芐西林抗性。

6. 載體大小
  這里唯一需要考慮的是，你是在處理大的 DNA 片段還是小的 DNA 片段。為了操作方便，載體必須是相對較小的分子。過大的載體可能會影響復制并導致穩定性問題。通常，質粒可以處理長達 15 kb 的插入片段。但也有一些特殊的質粒可以處理更大的插入物。
  任何蛋白質表達系統的最終目標都是生產出高質高量的重組蛋白質。表達載體有助于將外來遺傳物質導入宿主細胞，使目的基因在宿主細胞中表達，并促進目的蛋白質的鑒定和純化。表達載體對重組蛋白的生產起著決定性作用，因此選擇理想的表達載體意義重大。