ALPi——腸粘膜屏障保鏢
日期：2022-09-19 15:40:00
堿性磷酸酶：
堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP/ALP/AP）是一種單脂磷酸水解酶 ，廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織中，經(jīng)肝臟向膽外排出，參與人體的能量代謝。堿性磷酸 酶屬于同源二聚體，共有四種同功酶，其包含主要分布于肝臟、骨骼和腎臟組織中的非特異性同工酶，以及分 布在特定組織中的組織特異性磷酸酶，包括分布于腸粘膜的腸堿性磷酸酶（Intestin alalkaline Phosphatase, ALPi）、分布于胎盤的胎盤堿性磷酸酶（Placental alkaline phosphatase，PLAP）和分布在人 類生殖系統(tǒng)內(nèi)的生殖細胞堿性磷酸酶（Germcell alkaline phosphatase，GCAP）[1]。
1、什么是ALPi？
腸堿性磷酸酶（Intestinal alkaline phosphatase, ALPi） 位于腸粘膜的刷狀邊緣，能夠水解單磷酸脂，是一種由腸上皮細胞表達的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，不僅在粘膜 和腸腔內(nèi)保持活性，而且分泌到血清后也能保持活性，對維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡起到重要作用。由荷蘭生物制藥 公司AM-Pharma贊助的Peters和Lukas進行的臨床研究已證實當人和動物從腸道吸收內(nèi)毒素時，ALPi對內(nèi)毒素進 行充分滅活，使其失去大部分活性。因此ALPi可以用于針對內(nèi)毒素相關(guān)敗血癥腎損傷和結(jié)腸炎中炎癥的新方法 [2,3]。
2、ALPi與腸黏膜屏障作用機制
研究顯示，各種緊密連接蛋白的低表達可損害腸粘膜屏障功能，進而影響腸 粘膜通透性。腸道細菌、內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)等會通過受損的腸粘膜屏障進入內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致更多炎性介質(zhì)的釋放 ，激活全身炎癥反應(yīng)綜合征的進程，循環(huán)損害腸粘膜屏障功能，最終導(dǎo)致多臟器功能衰竭的發(fā)生。而ALPi可以 誘導(dǎo)閉鎖小帶蛋白1(Zonulaoccludens-1, ZO-1)、閉鎖小帶蛋白2(Zonulaoccludens-2, ZO-2)、閉鎖蛋白（Occludin），水 閘蛋白（Claudin）表達水平的升高，增強腸粘膜屏障功能。
2.1 ALPi維護腸黏膜機械屏障
腸道機械屏障作為腸黏膜屏障重要的一部分，其腸上皮細胞間緊密連接蛋白 發(fā)揮著重要的作用，而ALPi在維持細胞間緊密連接發(fā)揮作用。
Rentea等研究發(fā)現(xiàn)，壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠幼崽腸道對大分子物質(zhì)的通透 性增加約15倍，給予低劑量外源性牛ALPi后，其腸道通透性得到明顯改善 [4]。Hamarneh等首先通 過研究ALPi基因敲除小鼠和野生型小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠緊密連接蛋白表達量較野生型小鼠低,證實腸道 屏障受損與ALPi表達缺失相關(guān) [5]。說明ALPi在腸黏膜機械屏障維護發(fā)揮著重要作用。但是目前的 數(shù)據(jù)僅依據(jù)于實驗結(jié)果，對ALPi,和黏膜屏障以及蛋白間的信號通路影響機制尚不明確，仍需進一步研究。
2.2 ALPi支持腸黏膜免疫屏障
腸道免疫屏障由獲得免疫和固有免疫兩部分構(gòu)成, 免疫球蛋白A (immuno globulinA, IgA)和抗菌肽及黏蛋白分別構(gòu)成獲得免疫和固有免疫的重要效應(yīng)分子和活性成分。人體腸道中存在 大量的革蘭陰性細菌, 脂多糖(lipo poly saccharide, LPS)作為革蘭陰性細菌細胞壁重要組成部分，是引發(fā)腸 道炎癥反應(yīng)的重要因素。Bates等和Bentala等的研究發(fā)現(xiàn)ALPi可通過激活腸上皮細胞Toll樣受體(Toll-likereceptors, TLR4)基因表達，識別革蘭氏 陰性細菌外膜中的LPS并誘導(dǎo)宿主進行免疫應(yīng)答和損傷修復(fù)，巨噬細胞募集(級聯(lián)誘導(dǎo)嗜中性粒細胞)激活誘導(dǎo)核 因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和TLR3基因, 并通過MyD88依賴途徑抑制炎癥性細胞因 子白細胞介素(interleukin, IL-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6和IL-12 的表達, 從而抵抗腸道感染。TLR4的大量激活可能進一步抑制了TNF-α的表達, 抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) ，從而降低LPS的毒性 [6，7]。Hwang等研究發(fā)現(xiàn)也表明，ALPi通過TLR4/NF-κB介導(dǎo)途徑維 護腸黏膜屏障功能的正常 [8]。上述研究結(jié)果表明，ALPi可通過催化LPS去磷酸化，間接地介導(dǎo)腸 道炎性反應(yīng)的下調(diào)，從而參與腸黏膜免疫屏障功能的維護和調(diào)節(jié)(如圖1)。
圖1. 刷狀緣ALPi對腸道菌群和LPS誘導(dǎo)的炎癥的釋放的作用機制
圖片源自：DOI:10.11569/wcjd.v27.i23.1441
2.3 ALPi調(diào)節(jié)腸黏膜化學(xué)屏障
作為腸黏膜屏障中重要的一部分，化學(xué)屏障受損也會增加腸道炎癥的易感性 。ALPi主要在十二指腸中表達，可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)碳酸鹽的分泌情況，借此改變十二指腸表面的PH值，使影響體 內(nèi)炎癥的微生物組環(huán)境得到改善。Mizumori等研究發(fā)現(xiàn), 當黏膜表面pH值>8，ALPi表達量及酶的活性最高， 當黏膜表面pH較低時, ALPi所具有的ATP酶活性降低。提示ALPi作為腸道pH調(diào)節(jié)的堿性傳感器，在調(diào)節(jié)腸黏膜化 學(xué)屏障、在改善腸內(nèi)酸堿環(huán)境維持腸道穩(wěn)態(tài), 維持腸黏膜屏障功能的關(guān)鍵作用。
2.4 ALPi增強腸黏膜生物屏障
腸粘膜生物屏障的完整對維持腸道內(nèi)生物菌落有著重要的意義，已有研究表 明豬腸道細菌定植前后，腸道ALPi表達水平并無明顯變化，而在小鼠和大鼠腸道細菌定植后，ALPi的表達水平 降低 [9]。
而給小鼠口服大腸桿菌，構(gòu)建腹膜炎生物模型，然后用ALPi干預(yù)后檢測細菌 移植的情況，結(jié)果證明ALPi可以抑制小鼠的腹膜炎惡化和細菌移植情況。, 檢測細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK) 磷 酸化水平和ERK-特異性蛋白-1 (SP-1) -血管內(nèi)皮生長因子 ( VEGF) 和ERK-尾型同源異型核基因2 (Cdx-2) -緊 密連接蛋白2(Claudin-2)等信號通路蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)ALPi抑制Claudin-2和VEGF表達，降低黏膜通透性抑 制菌群位移來增強腸粘膜生物屏障。
3、ALPi對MLCK/pMLC信號通路的影響
MLCK/pMLC信號通路是炎癥相關(guān)的信號通路，可以被腫瘤壞死因子-α（ TNF-α）激活，導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)和組成的分子重組，引起閉鎖蛋白（Occludin）內(nèi)吞。為了研究ALPi對 TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細胞的屏障功能損害的抑制作用機制，劉翀等人研究了ALPi對炎癥相關(guān)MLCK/pMLC信 號通路的影響。Caco-2細胞中的MLCK和pMLC蛋白的表達，在TNF-α作用下明顯升高（p<0.01）。而加 入ALPi后，與TNF-α組比較，IAP+TNF-α組顯著抑制了MLCK（p<0.01）和pMLC（p<0.05）蛋 白的表達水平（圖2）。以上結(jié)果表明，ALPi抑制了TNF-α誘導(dǎo)的MLCK/pMLC信號通路的激活，抑制了炎癥 反應(yīng)的發(fā)生。
圖2. IAP對MLCK/pMLC信號通路的影響
**，與對照組相比，p<0.01；#，與TNF-α組相比，p<0.05；##，與TNF-α組相比，
p<0.01
圖片源自：https://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10159- 1022424869.htm
此外，由于L-PHE是ALPi特異性的抑制劑，經(jīng)實驗證明ALPi能夠通MLCK/pMLC信號通路，調(diào)節(jié)緊密連接蛋 白ZO-1、Occludin和Claudin-1緊密連接蛋的表達，從而降低TNF-α對Caco-2細胞屏障功能的損害。
4、ALPi與疾病的關(guān)系
4.1 腸堿性磷酸酶與腸粘膜屏障相關(guān)疾病
炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是累及腸道的一類特發(fā)性 腸道炎癥性疾病。腸源性細菌抗原引起的黏膜免疫應(yīng)答參與炎癥性腸病的發(fā)病機制，Toll樣受體配體--尤其是 脂多糖(LPS)對該病的維持起著重要作用，已有研究表明腸堿性磷酸酶能夠解毒LPS。對IBD小鼠經(jīng)口喂食外源性 的ALPi，可以在腸上皮細胞和巨噬細胞中誘導(dǎo)自噬，降低腸粘膜通透性，從而起到明顯的治療作用 [10] 。
4.2 腸堿性磷酸酶與壞死性小腸結(jié)腸炎
目前，ALPi在治療炎癥性腸病等方面應(yīng)用前景十分廣闊。從牛小腸提取的堿 性磷酸酶（Bovines Intestinal Alkaline Phopaatase，bALPi）是最常用的商品化ALPi。壞死性小腸結(jié)腸炎（ Necrotizingenterocolitis，NEC）病因復(fù)雜，Rentea等人研究發(fā)現(xiàn)補充ALPi可以降低NEC損傷的嚴重程度 [11]。
4.3 腸堿性磷酸酶與急性腎損傷
動物實驗表明，腎器官缺血損傷后，腎臟中的磷酸酶活性降低 [12] 。因ALPi對LPS有抑制作用，可以改善急性腎損傷（AKI）。對膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷（AKI）患者或敗 血病患者在AKI發(fā)病后48小時內(nèi)靜脈輸注堿性磷酸酶，能顯著改善腎功能，如血漿肌酐值下降和肌酐清除率升高 ，相關(guān)的接受ALPi治療的患者可以減少透析的持續(xù)時間.
4.4 腸堿性磷酸酶與代謝類疾病
Madhu等人發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，ALPi基因敲除小鼠腸道內(nèi)需氧菌和厭氧 菌的數(shù)量有所減少。當基因敲除小鼠口服ALPi后，其腸道菌群基本正常化 [13]。KaliannanK等人 通過實驗研究得到ALPi還與代謝性疾病有關(guān)的結(jié)論 [14]。Bhan等通過敲除小鼠ALPi基因，發(fā)現(xiàn)缺 乏ALPi的動物會患上2型糖尿病和高脂血癥 [15]，提示ALPi可能與糖尿病、高血脂等代謝性疾病相 關(guān)。美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的研究人員研究發(fā)現(xiàn)IAP的過表達可以通過維持腸道黏蛋白層的完整性來改善腸屏障 功能，進而限制腸源性LPS的易位，并減弱腸道對脂質(zhì)的吸收，由此減弱高脂肪和高膽固醇食物引起的動脈粥樣 硬化的發(fā)展。證明ALPi的表達增加可以對腸道屏障功能和代謝性疾病的發(fā)展起到直接的保護作用
5. CUSABIO公司ALPi相關(guān)產(chǎn)品
High Purity Validated by Western Blot
Excellent Bio-activity
Unit Definition: One unit is defined as the amount of enzyme required to cleave 1 nmol p-nitro-phenylphosphate(pNPP), in 1 minute at 37°C, pH10.0. The specific activity is > 10370.37 U/mg.
High Purity Validated by Western Blot
Excellent Bio-activity
Unit Definition: One unit is defined as the amount of enzyme required to cleave 1 nmol p-nitro-phenylphosphate (pNPP), in 1 minute at 37°C, pH10.0. The specific activity is > 8836.463 U/mg.
Recombinant Rat Intestinal-type alkaline phosphatase 1(ALPi)
Recombinant Rat Intestinal-type alkaline phosphatase 1(ALPi) (Active)
Recombinant Human Intestinal-type alkaline phosphatase (ALPi)
Recombinant Human Intestinal-type alkaline phosphatase(ALPi),partial
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