實(shí)驗(yàn)技術(shù)|蛋白免疫印跡WB（中）

日期：2019-03-20 11:12:22

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實(shí)驗(yàn)技術(shù)|蛋白免疫印跡WB（上）

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蛋白免疫印跡（WB）是基于抗原抗體的特異性結(jié)合作用，以檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白，并對其進(jìn)行半定量分析的一種方法。

主要用于靶標(biāo)蛋白特異性表達(dá)的定性或半定量分析，蛋白與蛋白或蛋白與DNA相互作用的后續(xù)分析，以及蛋白修飾的鑒定分析。

凝膠電泳

4.1 SDS-PAGE凝膠

利用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的聚合作用，可以形成一種網(wǎng)狀的凝膠結(jié)構(gòu)，具有一定的分子篩作用。蛋白在大量SDS膠束包裹下，形成SDS的電荷效應(yīng)，蛋白分子本身電荷被覆蓋，蛋白在電勢作用下，只與所包裹的SDS所帶負(fù)電荷相關(guān)，即反映分子量大小。SDS-PAGE的分辨率與所使用交聯(lián)劑丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度相關(guān)。不同濃度的交聯(lián)劑所形成的網(wǎng)狀分子篩孔徑不同，形成分子篩效應(yīng)。分離情況如下：

分離膠濃度	分離范圍（kDa）
8%	70-200
10%	25-70
12%	20-55
15%	15-45

✪ 丙烯酰胺凝膠的成分及作用

4.2 電泳液的配制與選擇

常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳對于分離30-250 kDa范圍內(nèi)的蛋白具有較好的分離作用，根據(jù)蛋白分子量大小的不同，參照分離情況表選擇合適的分離膠濃度。1L電泳液配方如下：

使用Glycine-Tris-gel電泳體系時(shí)，一般電泳條件為恒壓，濃縮膠60-80 V，分離膠100-120 V。電壓越小，跑的越慢，分離效果更好。

但對于分子量低于30 kDa的小分子蛋白，Glycine-Tris-gel體系分辨率不高，無法達(dá)到相應(yīng)的分離效果。Tricine相對于Glycine具有更好的電子遷移率和解離常數(shù)，使得小分子蛋白在濃縮膠內(nèi)具有更好的濃縮效應(yīng)，且在分離膠內(nèi)具有更高的分辨率。所以，對于小分子蛋白推薦使用電泳液配方如下：

使用Tricine-Tris-gel電泳體系時(shí)，一般條件為恒壓，電壓不宜過大，60-100V左右。

4.3 Protein Marker 與內(nèi)參選擇

在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求需要設(shè)置相應(yīng)對照。

◎ 分子量指示劑

合適范圍的蛋白Marker，可指示蛋白分子量大小，并在一定程度上反映電泳效果和轉(zhuǎn)膜效率。按照不同使用特性，目前所使用的Marker大致可以分為3種：普通非預(yù)染Marker、預(yù)染Marker、曝光Marker。

◎ 陽性對照

組織或細(xì)胞中已證實(shí)有相應(yīng)蛋白表達(dá)的樣本即陽性對照品。

◎ 內(nèi)參對照

由于管家基因編碼表達(dá)的蛋白在各種組織和細(xì)胞中的表達(dá)量相對恒定，故而在對蛋白進(jìn)行定量檢測時(shí)，需要將此類蛋白作為內(nèi)參，以校正蛋白定量和上樣的誤差。另外，內(nèi)參蛋白還可以用于監(jiān)測整套實(shí)驗(yàn)體系是否成功。

由于研究對象的不同，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?nèi)參蛋白進(jìn)行選擇：

此外，在選擇內(nèi)參蛋白時(shí)還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1. 注意某些特定條件下的內(nèi)參基因表達(dá)可能發(fā)生變化，而不適于作為內(nèi)參對照。比如藥物誘導(dǎo)或者外界刺激存在時(shí)，導(dǎo)致某些管家基因的表達(dá)量不再恒定，而是發(fā)生一定變化。需要結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)方案，并查詢相關(guān)文獻(xiàn)綜合考慮。

2. 目的蛋白與內(nèi)參蛋白大小應(yīng)存在差異，便于檢測操作和區(qū)分。如果選用的內(nèi)參蛋白大小與目的蛋白大小相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的顯影。隨后采用一抗二抗去除液洗去目的抗體，再進(jìn)行內(nèi)參抗體的孵育與顯影。

轉(zhuǎn) 膜

◎ 轉(zhuǎn)膜方式膜介質(zhì)的選擇

將電泳分離后的蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相介質(zhì)上，通常采用濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩種方法原理相同，只是施加電場的機(jī)械裝置和用于固定膠與膜的方式有所不同，半干轉(zhuǎn)用浸潤緩沖液buffer的多層濾紙?zhí)娲?/span>兩種方法比較如下：

在轉(zhuǎn)膜時(shí)，高電流作用下，短時(shí)間內(nèi)裝置產(chǎn)熱非常明顯，所以轉(zhuǎn)膜過程應(yīng)采取相關(guān)措施，以保持低溫環(huán)境。濕轉(zhuǎn)時(shí)，可以將裝置進(jìn)行冰浴，有利于散熱。半干轉(zhuǎn)時(shí)，不宜長時(shí)間進(jìn)行電轉(zhuǎn)，所以推薦大分子蛋白（100 kDa以上）采用濕轉(zhuǎn)。對于小分子蛋白和正常分子蛋白，濕轉(zhuǎn)與半干轉(zhuǎn)效率相差不大。對于高豐度，小塊膠，建議干轉(zhuǎn)，提高效率。低豐度，大塊膠，建議濕轉(zhuǎn)。

◎ 膜介質(zhì)的選擇

轉(zhuǎn)膜過程中使用的膜介質(zhì)，目前使用最多的包括兩種，即硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜。

NC膜的結(jié)合能力主要是與其純度相關(guān)，純度越高，與蛋白結(jié)合能力更強(qiáng)。但純度高的NC膜較脆，容易出現(xiàn)破碎的情況。相對于NC膜，PVDF膜具有更強(qiáng)的蛋白結(jié)合能力，且其具有更好的化學(xué)耐受性。

需要注意的是，PVDF膜使用前，需在甲醇中浸泡（>15 s）以活化膜上的正電基團(tuán)，并在轉(zhuǎn)膜液中平衡一段時(shí)間。另外，PVDF膜與NC膜都具有不同孔徑大小。對于小分子蛋白（<20 kDa），建議使用0.22 μm孔徑的膜，避免出現(xiàn)轉(zhuǎn)過的現(xiàn)象。正常情況下使用0.45 μm孔徑的膜即可。

◎ 蛋白分離與轉(zhuǎn)膜條件優(yōu)化

對于小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜，可從以下幾點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化：

1. 可以增大交聯(lián)劑濃度，采用15％丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。但對于15 Kda以下的蛋白，此膠的分辨率較低，建議在濃縮膠和分離

膠之間增加10％的間層膠，以增加小分子蛋白分辨率。

2. 采用Tris-Tricine電泳體系替代Tris-Glycine緩沖體系，達(dá)到更好的濃縮作用與分離效果。注意應(yīng)用該系統(tǒng)時(shí)，電壓不宜過大，60-80 V為宜。

3. 選取0.22 μm孔徑的膜介質(zhì)

4. 縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間，可采用干轉(zhuǎn)方式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

對于大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜，可從以下幾點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化：

1. 降低交聯(lián)劑濃度，采用8%-5%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，但需注意膠濃度越低，越容易破碎，操作時(shí)應(yīng)小心。

2. 轉(zhuǎn)膜時(shí)，電流適當(dāng)調(diào)大，轉(zhuǎn)膜時(shí)間延長，并避免轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)高熱，推薦濕轉(zhuǎn)4℃過夜。

3. 適當(dāng)降低轉(zhuǎn)膜緩沖液中的甲醇，可促進(jìn)膠中SDS分子與蛋白的分離，高濃度的甲醇對蛋白有固定作用，而不利于大分子蛋白泳出，可降低甲醇濃度至10%。

◎ 轉(zhuǎn)膜效率監(jiān)測

1. 預(yù)染Marker的轉(zhuǎn)膜情況在一定程度上反映了蛋白轉(zhuǎn)移效率。

2. 對膠進(jìn)行麗春紅染色，根據(jù)染色后的條帶查看是否轉(zhuǎn)膜成功。此過程為可逆過程，但不適用于尼龍膜的染色。

麗春紅染色液的配制：5%（V/V）乙酸，0.1%（W/V）麗春紅，ddH2O混勻，置于4℃保存。

麗春紅染色流程如下：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜或NC膜浸沒在麗春紅染色液中5-10min振蕩。取出印跡膜，用PBS洗滌3×5 min。觀察染色的紅色條帶，記錄轉(zhuǎn)膜情況。再次使用PBS洗滌3×5 min，以去除結(jié)合的麗春紅，便于后續(xù)WB檢測。

3. 對膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，此染色過程不可逆，但考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度較麗春紅高。

考馬斯亮藍(lán)染色液的配制：10%（V/V）冰醋酸，45%（V/V）甲醇，0.25%（W/V），ddH₂O混勻。

考馬斯亮藍(lán)脫色液的配制：25%（V/V）甲醇，8%（V/V）冰醋酸，ddH₂O混勻。

考馬斯亮藍(lán)染色流程如下：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜或NC膜浸沒在考馬斯亮藍(lán)染色液中，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫染色1 h（根據(jù)膠大小、厚度和溫度調(diào)整），至膠染成藍(lán)色。倒出染色液，將膠浸入脫色液中，置于水平搖床上緩慢搖動，室溫脫色4 h，至藍(lán)色背景脫去，蛋白條帶可見。

◎ 轉(zhuǎn)膜緩沖液的配制

1L轉(zhuǎn)膜緩沖液配制如下：

轉(zhuǎn)膜buffer需避光保存，可重復(fù)使用多次，但由于甲醇較易揮發(fā)，應(yīng)及時(shí)更換使用新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液。

封閉

◎ 封閉劑的選擇

固相介質(zhì)表面材質(zhì)不均一，有很多細(xì)小孔洞。當(dāng)?shù)鞍妆晦D(zhuǎn)移至固相介質(zhì)以后，通過非共價(jià)作用力吸附于固相介質(zhì)表面。但并不是所有位點(diǎn)都吸附了蛋白，故需要將封閉劑吸附到固相介質(zhì)上，以避免抗體分子直接吸附到膜上，產(chǎn)生假陽性或者高背景的結(jié)果。

選擇封閉劑的原則是封閉劑應(yīng)能夠封閉膜上所有未結(jié)合位點(diǎn)，而不干擾目的蛋白的結(jié)合，且不與靶蛋白表位進(jìn)行結(jié)合，不與抗體及其他試劑有交叉反應(yīng)。

常用封閉劑如下：

不同封閉劑的比較實(shí)驗(yàn)如下：

需要特別注意的是，對于磷酸化的蛋白，進(jìn)行檢測時(shí)不建議使用脫脂奶粉和酪蛋白作為封閉劑，并使用TBST替代PBST。對于封閉劑的選擇需要根據(jù)結(jié)果情況進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，對于大部分抗體在用脫脂奶粉時(shí)，可以達(dá)到好的封閉效果，但有些抗體在使用BSA封閉時(shí)，能夠更好的降低背景。封閉條件一般為室溫振蕩封閉1h。

孵育一抗

按照產(chǎn)品說明，對一抗進(jìn)行適當(dāng)稀釋，一抗稀釋液一般與封閉劑組分相同。另外，建議

選擇已有驗(yàn)證的一抗。另外，一抗建議4℃孵育過夜，使抗原抗體充分結(jié)合。

對于一抗稀釋比例最好做梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最佳稀釋比例。此時(shí)可采用簡單的Dot blot法進(jìn)行摸索。使用NC膜，在膜上依次點(diǎn)上不同上樣量的樣本，自然風(fēng)干。待膜完全吸收樣本后，進(jìn)行封閉。隨后，按上樣梯度對膜進(jìn)行裁剪，分別采用不同濃度梯度的一抗孵育，相同二抗孵育。最后ECL發(fā)光底物孵育顯影。觀察顯影情況進(jìn)行抗體稀釋比范圍的初步判定。

孵育二抗

◎ 實(shí)驗(yàn)操作

1. 二抗孵育前，用PBST/TBST洗膜3×10 min，以去除未結(jié)合的一抗。

2. 對二抗進(jìn)行適當(dāng)稀釋，室溫孵育1h。

3. 二抗孵育完成后，用PBST/TBST洗膜3×10 min，以去除未結(jié)合的二抗，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

◎ 二抗選擇

1. 物種來源

不建議選擇來源于鼠或兔來源的二抗，因其與人的同源性較大，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致高背景。常使用羊或驢來源二抗，所使用二抗必須與一抗種屬來源不同，且需根據(jù)一抗種屬選擇抗該種屬的二抗。另外，還應(yīng)注意所使用單克隆一抗的亞型，選擇針對一抗亞型的二抗。

2. 純化方式

對于目前抗體純化方式主要有Protein G/A純化和抗原親和純化。前者可與血清中所有抗體IgG分子發(fā)生結(jié)合，抗原特異性無區(qū)分。后者是通過能夠與抗體特異性識別的配體或者受體來進(jìn)行結(jié)合洗脫，可以純化血清中的特異性抗體成分。所以，親和純化二抗可大大減少非特異性結(jié)合，提高蛋白的檢測特異性。

3. 合適的標(biāo)記物

WB中最常使用二抗標(biāo)記物為酶標(biāo)二抗，如辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酯酶AP。HRP特異性強(qiáng)，作用底物較為廣泛，經(jīng)濟(jì)快速，且穩(wěn)定。AP雖然更為靈敏，但其背景往往更高，且在實(shí)驗(yàn)樣本中可能存在的內(nèi)源性磷酸酯酶會干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，使用AP標(biāo)記二抗時(shí)，封閉劑也應(yīng)謹(jǐn)慎選擇，避免磷酸酯酶的干擾。

不同廠家二抗（HRP標(biāo)記）的比較實(shí)驗(yàn)如下：