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好物好推薦:內參抗體!

日期:2018-11-28 10:10:48

內參抗體

       內參即內部參照(Internal Control),對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。
       
       在Western Blot實驗中,除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外,還需要進行內參的檢測,以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差,保證實驗結果的準確性。
       此外使用內參可以作為空白對照,檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。
     
      常用的細胞總蛋白質內參有GAPDH和細胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。對于一些植物的樣本,則需要特別的植物Actin蛋白作為內參。當實驗樣品中只是核蛋白,而不是細胞總蛋白提取液時,可以用組蛋白H(Histone H),或者增殖細胞核抗原(PCNA)等為核內參抗體。而在一些特別的針對線粒體作為微環境的研究課題時,則需要提取線粒體總蛋白并檢測其中的目標蛋白含量,常用COX IV或VDAC1作為內參抗體。
       在選擇內參時,需要綜合考慮待檢蛋白的分子量大小以及在細胞中的位置,內參與檢測的目的蛋白的分子量應相差5kDa以上。
 
常見的內參抗體:
 
1)GAPDH內參抗體
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)是參與糖酵解的一種關鍵酶,由4個30-40kDa的亞基組成,分子量146kDa,檢測條帶大約在36kDa。 GAPDH基因幾乎在所有組織中都高水平表達,可廣泛用作Western Blot蛋白質標準化的內參。
不適合用于檢測30kDa-40kDa大小目標蛋白的WB實驗中。在某些細胞中,由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高,也不適合做內參。
 
 
2)β-Actin內參抗體
Actin即肌動蛋白,是細胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種,其中四種是不同肌肉組織特異性的,其余兩種廣泛分布于各種組織中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作為內參是得到了公認的,這是針對大多數組織和細胞來說的,它廣泛分布于細胞漿內,表達量非常豐富,其含量占所有細胞總蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情況下,如脂肪組織或細胞內,β-Actin的表達量就很少。β-actin由375個氨基酸組成,分子量大小為42-43kDa左右。
適合用于檢測38kDa-48kDa大小目標蛋白的WB實驗中。在脂肪組織里,β-Actin的表達量非常低,不適合作為內參。
 
 
3)β-Tubulin抗體
Tubulin即微管蛋白,是細胞的一種骨架蛋白。Tubulin分為α、β、γ、δ、ε等多種tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成異源二聚體,是形成微管的最主要的兩種Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kDa和50kDa,其實際檢測條帶均在55kDa左右。作為內參,β-tubulin的蛋白水平通常不會發生改變,因此被廣泛用于Western Blotting時上樣量是否一致的參照,也常被用于免疫染色觀察細胞的微管結構。
不適合用于檢測50kDa-60kDa大小目標蛋白的WB實驗中。在脂肪組織或細胞內,β-Actin的表達量很少,不適合做內參。
 
 
Tips: 內參的選擇還需考慮實際的實驗環境:
 
在做多組織多細胞樣本對比表達量時,最好選用GAPDH作為內參,因為GAPDH是代謝類蛋白,在活組織中表達比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結構蛋白,不同組織的細胞結構會有差異性。
做誘導后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時,應選擇結構蛋白作為內參,如β-Actin 和β-Tubulin。
設計實驗方案的時候應該考慮實際的實驗因素并查詢相應文獻,在實驗過程中也應該注意內參表達是否出現異常。
做 Western Blot實驗時,內參的條帶強度也要適當控制。不要讓內參條帶發生過度曝光的情況,尤其是用 X 膠片曝光的。如果內參條帶過度曝光,條帶會顯得很寬,妨礙對條帶正確強度的判讀,進而影響對其他實驗結果的判斷。最好的內參結果是: 窄窄的,黑色實心條帶。
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華美內參抗體特別推薦
 
貨號:CSB-MA000071M0m
種屬反應性:Human
免疫原:Recombinant Human GAPDH protein
應用范圍:ELISA, WB, IHC, IP, IF, FC
引用文獻:A fluorescence method for determination of glucose transport by intestinal BBMV of common carp , Yang LP,et al.Anal Biochem,Aug 26
 
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