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血清樣本與血漿樣本在ELISA試劑盒檢測中的選擇差異?

日期:2025-06-24 16:18:17

    在ELISA試劑盒檢測中,血清樣本與血漿樣本的選擇差異主要源于兩者的成分組成、制備方法及理化性質的不同。這些差異會直接影響檢測的準確性、特異性及實驗操作的便利性。以下從多個維度詳細解析兩者的選擇要點及應用場景:

一、樣本制備與成分差異
1. 制備流程對比
項目 血清樣本 血漿樣本
采集方式 靜脈采血后,室溫靜置30-60分鐘使血液凝固,再離心(3000rpm,10分鐘)獲取上清液。 采血時加入抗凝劑,立即顛倒混勻,離心(3000rpm,10分鐘)獲取上清液。
關鍵步驟 等待凝血過程,可能產生纖維蛋白凝塊,需過濾或二次離心。 抗凝劑選擇需與檢測項目匹配,避免抗凝劑干擾。
處理時間 凝固+離心約1-2小時,耗時較長。 抗凝后可立即離心,處理時間短(約30分鐘)。

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2. 成分差異對檢測的影響
(1)血清:
        不含纖維蛋白原,但含有凝血因子降解產物(如D-二聚體)、抗體、細胞因子、激素等。
        優點:成分更接近生理狀態,適用于檢測與凝血無關的指標(如抗體、多數細胞因子)。
        缺點:凝血過程中可能釋放細胞內物質(如乳酸脫氫酶),導致溶血風險;纖維蛋白凝塊可能堵塞加樣針或干擾反應。
 
(2)血漿:
        含纖維蛋白原及抗凝劑(如肝素、EDTA、檸檬酸鈉),不含凝血因子 Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ等(因未激活凝血過程)。
        優點:抗凝劑可抑制凝血,適合檢測易降解的分子(如某些激素、神經遞質),且處理快速,適合急診檢測。
        缺點:抗凝劑可能與檢測體系中的抗體或抗原結合,導致假陽性或假陰性(如肝素帶負電荷,可與帶正電荷的蛋白結合)。
 
二、抗凝劑對 ELISA 檢測的干擾機制
1. 常見抗凝劑的影響
抗凝劑類型 作用機制 對ELISA的干擾 適用檢測項目
肝素 抑制凝血酶和因子Xa 與帶正電荷的蛋白(如抗體、抗原)結合,導致非特異性吸附,增加背景信號;可能激活補體系統,干擾免疫反應。 不適合檢測抗體、細胞因子;適合檢測與肝素無關的指標(如病毒核酸)。
EDTA 螯合Ca²?,抑制凝血酶激活 可能螯合檢測體系中的Ca²?依賴性蛋白(如某些酶標抗體),影響酶活性;對依賴Ca²?的抗原 - 抗體結合有抑制作用。 適合檢測不依賴Ca²?的指標(如多數細胞因子、病毒抗體)。
檸檬酸鈉 螯合Ca²?,抑制凝血酶生成 對pH影響較小,但高濃度可能稀釋樣本,降低檢測靈敏度;可能與某些抗體的Fc段結合,導致假陽性。 適合檢測凝血因子、補體成分等;不適合檢測需中性pH環境的指標。

2. 干擾案例
    肝素干擾實例:在檢測IL-6時,肝素可與IL-6的受體結合,導致ELISA結果偏低;在檢測抗磷脂抗體時,肝素可能與抗體競爭結合位點,導致假陰性。
    EDTA干擾實例:在檢測Ca²?依賴性蛋白(如組織因子)時,EDTA會螯合 Ca²?,使蛋白失活,導致結果偏低。
 
三、檢測項目與樣本類型的匹配原則
1. 優先選擇血清的檢測場景
    抗體檢測:如病原體抗體(HIV、HBsAb)、自身抗體(ANA、抗dsDNA抗體)等,血清中抗體濃度穩定,且凝血過程不影響抗體活性。
    細胞因子與炎癥因子:如TNF-α、IL-1β等,血清中這些因子的含量與生理狀態一致性高,且不受抗凝劑干擾。
    激素檢測:如甲狀腺激素(T3、T4)、性激素等,血清中的激素結合蛋白(如甲狀腺素結合球蛋白)含量穩定,適合定量分析。
    腫瘤標志物:如 CEA、AFP 等,血清樣本的檢測標準化程度高,臨床參考范圍更明確。
 
2. 優先選擇血漿的檢測場景
    易降解分子檢測:如兒茶酚胺(腎上腺素、去甲腎上腺素)、前列腺素等,血漿抗凝處理可快速終止代謝,保持分子穩定性。
    凝血相關因子:如凝血因子Ⅷ、Ⅸ,血漿未激活凝血過程,可準確反映因子含量;而血清因凝血過程消耗因子,不適用。
    急診或快速檢測:血漿處理時間短,適合需要立即出結果的場景(如急診感染標志物檢測)。
    特定抗凝劑匹配的檢測:如使用檸檬酸鈉抗凝的血漿適合檢測凝血因子,使用EDTA抗凝的血漿適合檢測某些酶類(如乳酸脫氫酶)。
 
四、樣本處理對檢測結果的影響
1. 溶血、脂血的影響差異
(1)溶血:
        血清樣本:凝血過程中紅細胞破裂可能導致溶血,釋放血紅蛋白及細胞內酶(如 LDH),血紅蛋白可與酶標抗體競爭結合位點,導致假陰性;細胞內酶可能干擾底物顯色。
        血漿樣本:采血時混勻不當或離心速度過高可能導致溶血,但抗凝劑可減少凝血過程中的紅細胞損傷,溶血風險相對較低。
 
(2)脂血:
        兩者均可能因脂質顆粒干擾光吸收,導致OD值偏高,出現假陽性。但血漿樣本因抗凝處理后可立即離心,若存在脂血可通過高速離心(如4000rpm)或脫脂處理(如正己烷萃取)改善,而血清樣本的脂血處理更困難。
 
2. 儲存與穩定性
    短期儲存(<24小時):血清和血漿均可4℃保存,但血清需注意避免反復凍融(可能導致蛋白變性);血漿需注意抗凝劑是否在低溫下析出(如檸檬酸鈉可能結晶)。
    長期儲存(>24小時):均需-20℃或-80℃凍存,血清凍融次數建議≤3 次,血漿因抗凝劑存在,凍融后成分更穩定(如肝素可抑制某些酶的活性)。
 
五、試劑盒說明書的推薦與實驗驗證
1. 試劑盒設計的樣本類型偏好
    多數ELISA試劑盒推薦血清:因血清成分更接近臨床常規檢測樣本,且抗凝劑干擾的可能性低。例如,腫瘤標志物檢測試劑盒通常明確標注 “僅適用于血清樣本”。
    特定試劑盒推薦血漿:如凝血因子檢測試劑盒、兒茶酚胺檢測試劑盒,會明確要求使用指定抗凝劑(如檸檬酸鈉)的血漿。
 
2. 跨樣本類型使用的驗證要求
    若需用血漿替代血清(或反之),需進行以下驗證:
    平行性試驗:用同一批樣本的血清和血漿分別檢測,比較結果的相關性(如 Pearson相關系數需>0.9)。
    回收率試驗:向樣本中添加已知濃度的標準品,檢測回收率(應在80%-120%范圍內)。
    干擾試驗:檢測抗凝劑是否對體系產生干擾(如添加肝素到血清樣本中,觀察OD值變化)。
 
六、臨床與科研中的選擇策略
1. 臨床檢測的優先原則
    常規項目:如肝功能、腎功能、腫瘤標志物,優先選血清,因臨床參考區間基于血清建立,且醫院檢驗科血清樣本處理流程更成熟。
    急診項目:如降鈣素原(PCT)、C反應蛋白(CRP),優先選血漿,因處理時間短,可快速出結果。
    凝血相關項目:如D-二聚體、纖維蛋白原,必須選血漿(檸檬酸鈉抗凝),血清因凝血過程消耗相關因子,結果不準確。
 
2. 科研實驗的注意事項
    機制研究:若檢測目標為細胞分泌因子(如細胞培養上清中的細胞因子),樣本類型需與體內環境一致(如血清模擬體內血液循環狀態)。
    縱向研究:需保持樣本類型一致(如所有時間點均用血清或血漿),避免因樣本差異導致結果波動。
    多中心研究:需統一樣本類型及抗凝劑種類,減少實驗誤差(如多中心檢測IL-6時,統一使用EDTA抗凝血漿)。
 
七、樣本選擇的決策流程
    明確檢測目標:分析檢測分子的性質(如是否易降解、是否依賴凝血因子)。
    查閱試劑盒說明:嚴格遵循試劑盒推薦的樣本類型及抗凝劑要求。
    評估抗凝劑干擾:若必須使用血漿,選擇與檢測體系兼容的抗凝劑(如EDTA適用于多數蛋白檢測,肝素僅在特定情況下使用)。
    優化樣本處理:血清需避免溶血和凝塊,血漿需確保抗凝劑與血液比例正確(如檸檬酸鈉與血液比例1:9)。
    實驗驗證:跨樣本類型使用時,通過平行性、回收率等試驗確認結果可靠性。
 
    通過以上維度的綜合考量,可最大限度減少血清與血漿樣本在ELISA檢測中的選擇偏差,確保結果的準確性與可重復性。

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