如何鑒定重組蛋白的表達(dá)和純化效果？
日期：2025-05-06 11:20:00
可以通過(guò) SDS - PAGE 電泳，觀察蛋白條帶的大小和純度，與預(yù)期的蛋白分子量進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)檢測(cè)是否有雜蛋白條帶；Western blotting 可用于檢測(cè)目的蛋白的特異性，通過(guò)與特異性抗體結(jié)合來(lái)確認(rèn)表達(dá)的蛋白是否為目標(biāo)蛋白；還可以采用質(zhì)譜分析，準(zhǔn)確鑒定蛋白的氨基酸序列和分子量，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白的身份和純度。
鑒定重組蛋白的表達(dá)和純化效果可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：
表達(dá)效果鑒定
SDS - PAGE 電泳
原理：根據(jù)蛋白分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)染色后，可觀察到蛋白條帶。
應(yīng)用：將誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞裂解液進(jìn)行 SDS - PAGE 電泳，與未誘導(dǎo)的對(duì)照組相比，若在預(yù)期分子量大小處出現(xiàn)明顯的新增條帶，說(shuō)明重組蛋白成功表達(dá)。同時(shí)，可通過(guò)條帶的亮度初步判斷蛋白的表達(dá)量。
Western blot
原理：結(jié)合了 SDS - PAGE 的分離能力與抗體的特異性識(shí)別能力，先通過(guò)電泳分離蛋白，再將其轉(zhuǎn)移到固相膜上，用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。
應(yīng)用：能檢測(cè)出目的蛋白的表達(dá)情況，排除非特異性條帶的干擾，具有更高的特異性和靈敏度。尤其適用于低表達(dá)量蛋白或與其他蛋白分子量相近難以通過(guò) SDS - PAGE 準(zhǔn)確判斷的情況。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）
原理：利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過(guò)酶標(biāo)二抗結(jié)合底物顯色來(lái)檢測(cè)蛋白。
應(yīng)用：可對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量分析，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中目的蛋白的含量，常用于大規(guī)模篩選表達(dá)量高的細(xì)胞株或評(píng)估不同培養(yǎng)條件下蛋白的表達(dá)水平。
純化效果鑒定
SDS - PAGE 電泳
應(yīng)用：純化后的蛋白進(jìn)行 SDS - PAGE 電泳，若蛋白條帶單一，說(shuō)明純化效果較好，雜蛋白較少。還可通過(guò)與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比條帶亮度，半定量評(píng)估純化后蛋白的濃度。
高效液相色譜（HPLC）
原理：基于不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離和分析。
應(yīng)用：根據(jù)蛋白的大小、電荷、疏水性等特性選擇合適的色譜柱，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行分析。可得到蛋白的純度信息，峰型尖銳且單一的色譜峰表明蛋白純度高，同時(shí)能通過(guò)峰面積計(jì)算蛋白的相對(duì)含量。
質(zhì)譜分析
原理：將蛋白樣品離子化后，根據(jù)其質(zhì)荷比進(jìn)行分離和檢測(cè)，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)來(lái)鑒定蛋白。
應(yīng)用：不僅能確定純化后的蛋白是否為目標(biāo)重組蛋白，還能分析其氨基酸序列、翻譯后修飾等信息，是鑒定蛋白最為準(zhǔn)確的方法之一，對(duì)于驗(yàn)證蛋白的準(zhǔn)確性和完整性具有重要意義。
