泛素化酵母雙雜交原理
日期：2023-06-29 17:03:48
泛素化酵母雙雜交（ubiquitin-based yeast two-hybrid，UB-TH）是用于檢測蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法。它基于酵母細胞中的蛋白質(zhì)泛素化機制和雙雜交原理。
泛素化是指將泛素分子共價地附著到其他蛋白質(zhì)上的過程。在UB-TH實驗中，目標是研究一個蛋白質(zhì)與另一個蛋白質(zhì)的相互作用。為了進行這個實驗，如下步驟被執(zhí)行：
構(gòu)建酵母表達載體：首先，目標蛋白質(zhì)的編碼序列被克隆到一個表達泛素結(jié)構(gòu)域的載體中。該載體還包含可以激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的報告基因。
構(gòu)建酵母融合表達載體庫：其次，構(gòu)建一個酵母表達多肽庫，其中每個多肽都與一個蛋白質(zhì)編碼序列連接。這些多肽通常是來自一個復(fù)雜的生物樣品，如組織提取物或cDNA文庫。
HTDNA（High-throughput DNA）雙雜交篩選：然后，將目標蛋白質(zhì)表達載體與融合表達載體庫一起轉(zhuǎn)化到酵母細胞中。如果目標蛋白質(zhì)與庫中的任何一個融合蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，目標蛋白質(zhì)的泛素結(jié)構(gòu)域?qū)⒈环核鼗＿@導致目標蛋白質(zhì)與報告基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制，從而產(chǎn)生可測量的熒光或生長。
驗證相互作用：通過進一步驗證，確認在雙雜交篩選中檢測到的相互作用是否真實有效。常見的驗證方法包括重復(fù)酵母雙雜交、共沉淀實驗等。
通過UB-TH原理，可以鑒定和分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進而理解細胞中的信號傳遞和調(diào)節(jié)機制。它在功能基因組學和藥物研發(fā)等領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。
