超速離心提取外泌體的過(guò)程

日期：2023-05-16 13:20:15

外泌體（extracellular vesicles，EVs）是30-1000納米的細(xì)胞外小囊泡，由多種類型的細(xì)胞分泌并在細(xì)胞間傳遞信息，具有重要的生理和病理功能。超速離心是目前提取外泌體的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，下面將介紹超速離心提取外泌體的詳細(xì)過(guò)程。

1、樣品收集及預(yù)處理

首先，需要選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)基或體液，并進(jìn)行一定的預(yù)處理。例如，將細(xì)胞培養(yǎng)液或血清在2000×g離心10分鐘去除細(xì)胞殘?jiān)退樾?。?duì)于不同的樣本類型，需要采用不同的處理方法，確保樣品的干凈和高品質(zhì)。

2、超速離心制備外泌體樣品

將處理后的樣品通過(guò)不同的離心步驟去除細(xì)胞碎屑、大顆粒物質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終得到外泌體樣品。具體步驟如下：

1、300×g離心10分鐘：去除細(xì)胞碎屑和大顆粒物；

2、2000×g離心30分鐘：去除大量細(xì)胞碎屑和細(xì)胞器，得到粗外泌體（EVs P1）沉淀；

3、10000×g離心70分鐘：去除小型碎片和膜片，得到中外泌體（EVs P2）沉淀；

4、100000×g離心120分鐘以上：去除殘留蛋白和低密度顆粒物，得到純化外泌體（EVs P3）沉淀。

注意，在每次離心后將上清液收集備用。此外，所有步驟都需要在冰箱內(nèi)進(jìn)行，以防止樣品受熱或氧化，影響外泌體的完整性和質(zhì)量。

3、洗滌和濃縮外泌體

為了去除離心過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和其它污染物，需要對(duì)P3沉淀進(jìn)行洗滌。常用的洗滌液包括PBS等緩沖鹽溶液。將P3沉淀加入PBS中，在低速離心下重新沉淀，取上清液繼續(xù)沉淀重復(fù)此步驟。這樣反復(fù)洗滌2-3次，最終得到較為純凈的外泌體樣品。

濃縮外泌體樣品是為了提高外泌體濃度和便于進(jìn)一步分析。利用超濾膜或納濾管等裝置可以將外泌體樣品濃縮至需要的體積。同時(shí)，為了避免外泌體的損失和污染，要確保濃縮過(guò)程中的溫度和壓力等參數(shù)控制合適。

4、外泌體質(zhì)量評(píng)估

確定超速離心提取外泌體后，需要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和表征。常見的質(zhì)量評(píng)估方法包括針對(duì)外泌體特異性標(biāo)記蛋白（如CD63、CD9等）的WB和ELISA檢測(cè)，以及電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)和大小等。此外，也可以通過(guò)納米顆粒追蹤分析儀NanoSight等設(shè)備進(jìn)行粒徑和分子數(shù)量的測(cè)定。

超速離心是目前提取外泌體的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，主要依靠離心力去除細(xì)胞碎屑、蛋白質(zhì)和小顆粒物，得到較干凈和高品質(zhì)的外泌體樣品。但是，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品處理、離心條件和數(shù)據(jù)分析等方面均需要進(jìn)行仔細(xì)和完善的規(guī)劃和調(diào)整，才能獲得準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。