小鼠E-Tag抗體檢測制備
日期：2023-06-12 14:33:58
小鼠E-Tag抗體是一種廣泛應用于免疫印跡、免疫沉淀等實驗中的重要試劑，可用于檢測蛋白質中所攜帶的C-terminal E標簽。本文將介紹小鼠E-Tag抗體的制備過程。
一、抗原制備：
E-Tag是一種典型的C-terminal標簽，由8個氨基酸組成，即DYKDDDDK。首先需要合成E標簽肽段，然后將其偶聯到載體蛋白上，以便制備抗原。可以使用多種載體蛋白，如GST、MBP、His-Tag等。將E標簽肽段插入載體蛋白基因的N或C端，通過表達、純化和與大豆凝集素分離柱層析等步驟制備純化的抗原。
二、免疫小鼠：
將純化的E標簽抗原溶液與小鼠進行免疫，注射方法可根據實驗需求和小鼠品系選擇靜脈注射、皮下注射等方式。建議對小鼠進行4-5次免疫，每次間隔2-3周，以盡可能提高免疫效果。為了提高抗體的特異性與純度，建議在最后一次免疫前進行預測血清抗原酶聯免疫吸附實驗（ELISA）以判斷小鼠體內抗體含量和特異性。選定最理想的小鼠后，采集其脾細胞或骨髓進行細胞融合。
三、雜交瘤細胞制備：
將小鼠脾細胞與骨髓細胞進行混合，用PEG或電穿孔法將其融合，形成雜交瘤細胞。將細胞分配到96孔板中，在含有腎上腺素的RPMI1640培養基中孵育，篩選并揀選抗體陽性的雜交瘤細胞。
四、抗體生產：
將揀選得到的雜交瘤細胞擴展到較大規模的細胞培養中，并進行抗體生產。通常情況下，每隔3-4天換一次新的培養液，并逐漸增加抗體的濃度。待培養液中的抗體濃度達到一定水平后，可通過多種方法如親和層析、蛋白A/G柱層析等來純化抗體。
五、抗體檢測鑒定：
制備好的小鼠E-Tag抗體需要進行鑒定，以確保其具有正確的免疫反應性和特異性。常用的鑒定方法包括免疫印跡、免疫熒光檢測、ELISA等。其中免疫印跡是最常用的鑒定方法，通過與已知含E標簽的蛋白在免疫印跡膜上進行反應，以判斷抗體的特異性和敏感性。
制備小鼠E-Tag抗體的主要步驟包括抗原制備、免疫小鼠、雜交瘤細胞制備、抗體生產和抗體鑒定等。這些步驟需要仔細操作，確保抗體的質量和特異性，從而為后續的免疫學研究提供可靠的實驗手段。
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