中和試驗(yàn)檢測應(yīng)用

日期：2010-07-30 14:59:01

病毒或毒素與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，失去對(duì)易感動(dòng)物的致病力，謂之中和試驗(yàn)。本試驗(yàn)主要用于：（1）從待檢血清中檢出抗體，或從病料中檢出病毒，從而診斷病毒性傳染??；（2）用抗毒素血清檢查材料中的毒素或鑒定細(xì)菌的毒素類型；（3）測定抗病毒血清或抗毒素效價(jià)；（4）新分離病毒的鑒定和分型，中和試驗(yàn)不僅可在易感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行，亦可在細(xì)胞培養(yǎng)上或雞胚上進(jìn)行。試驗(yàn)方法主要有簡單定性試驗(yàn)、固定血清稀釋病毒法、固定病毒稀釋血清法、空斑減少法等。

1、血清中和實(shí)驗(yàn)鑒定新城疫

血清中和實(shí)驗(yàn)既可用已知抗雞新城疫病毒的血清來鑒定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒來測定雞血清中是否含有特異性抗體，以確定雞群是否感染過新城疫。中和實(shí)驗(yàn)可以在雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)以及易感雞中進(jìn)行。方法是：在雞新城疫免疫血清（或待檢血清）中，加入一定量的待檢病毒（或已知病毒），兩者混合均勻后，接種10～11日齡的SPF雞胚，或雞胚成纖維細(xì)胞，或有易感性的雞，并設(shè)立不加血清的病毒對(duì)照。結(jié)果注射血清和病毒混合材料的雞胚或雞不死亡，雞胚成纖維細(xì)胞無病變，而對(duì)照組死亡或細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)病變，則肯定為新城疫病毒。

2、血清中和實(shí)驗(yàn)診斷豬瘟

將不同稀釋度的血清與已知濃度的稀釋病毒混合，再接種細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)，18-24h后進(jìn)行熒光抗體檢查；或與豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）中和，接種到兔中觀察兔體溫反應(yīng)，以此確定血清的終點(diǎn)滴度。在西歐最常用的方法是過氧化物酶中和實(shí)驗(yàn)（NPLA），而在一些北美洲和拉丁美洲國家則多使用免疫過氧化物酶單層實(shí)驗(yàn)（1PMA）方法。

3、血清中和實(shí)驗(yàn)檢測豬繁殖與呼吸綜合征

一般來說，在群體水平上血清學(xué)診斷易操作，特異性強(qiáng)，敏感性高。但對(duì)個(gè)體的檢測則比較困難，有時(shí)出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，但可以在2～3周后取樣復(fù)測解決此問題。血清學(xué)檢測一般用吸附實(shí)驗(yàn)（如IPMA、IF、ELISA），這些實(shí)驗(yàn)常用某種抗原型的病毒進(jìn)行，對(duì)其他抗原異型病毒抗體的靈敏度較低。應(yīng)用抗體結(jié)合試驗(yàn)，在病豬感染了7～14天檢出抗病毒抗體，30～50天抗體滴度出現(xiàn)高峰。有些在病豬感染后3～6個(gè)月內(nèi)血清轉(zhuǎn)為陰性，有些病豬血清陽性維持較久。中和抗體在病豬感染后出現(xiàn)較慢，但滴度不高?？稍诟腥竞?SPAN lang=EN-US>3-4周檢測到中和抗體，這種抗體能維持1年或更長時(shí)間。有報(bào)道，在血清中和實(shí)驗(yàn)中使用補(bǔ)體能提高試驗(yàn)的靈敏度。關(guān)于病豬感染后血清陽性持續(xù)時(shí)間的長短，目前尚未進(jìn)行廣泛深入的研究，因其有可能隨實(shí)驗(yàn)方法不同而異。母源抗體半衰期為12～14天，一般仔豬在出生后4～8周內(nèi)可檢測到病毒，隨母豬生產(chǎn)時(shí)的滴度及所用試驗(yàn)方法而異。在污染的環(huán)境中，血清學(xué)檢測為陽性的母豬所產(chǎn)仔豬能在3～6周齡時(shí)血清轉(zhuǎn)為陽性。應(yīng)用巨噬細(xì)胞分離病毒以及利用兩類血清型病毒的IPMA在實(shí)驗(yàn)室容易操作，這種試驗(yàn)可用MARC-145細(xì)胞系增殖歐洲型病毒和美洲型病毒操作。使用MARC-145細(xì)胞系做間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（1FA）能順利進(jìn)行PRRSV血清學(xué)反應(yīng)。目前，靈敏度高、特異性強(qiáng)商品化的ELISA試劑盒已經(jīng)上市。同時(shí)，國內(nèi)學(xué)者還開發(fā)了乳膠凝集試劑盒，可用于PRRSV抗體快速監(jiān)測。

血清中和實(shí)驗(yàn)檢測PRRS抗體雖然特異性好，但PRRS的SN抗體比IFA抗體在血清中出現(xiàn)得晚，一般在感染后的4～6周才出現(xiàn)中和抗體，因此SN不適宜進(jìn)行早期診斷。Christianson等（1992）報(bào)道SN的敏感性比IFA低，Yoon等（1994）對(duì)常規(guī)SN進(jìn)行改良，在實(shí)驗(yàn)中加入20%豚鼠血清以增加補(bǔ)體的含量，從而提高SN的敏感性，在感染后的9～11天即可檢測到較高滴度的SN抗體。SN抗體比IFA抗體存留的時(shí)間長，可維持半年以上。但由于對(duì)急性感染的敏感性較差，要求血清無污染，而且細(xì)胞培養(yǎng)工作量大，技術(shù)性強(qiáng)，目前僅限于實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)用。

4、病毒中和實(shí)驗(yàn)（VNT）診斷禽流感

以中和實(shí)驗(yàn)來鑒定或滴定流感病毒時(shí)，常用雞胚或組織培養(yǎng)細(xì)胞，操作方法與其他病毒（如NDV）的中和實(shí)驗(yàn)相同。一般常用固定病毒稀釋血清法，IOOEIDs或1000TCID5的AIV與RED處理過的倍比稀釋的血清等量混合，室溫lh，每個(gè)雞胚或每瓶細(xì)胞接種0.2ml，每個(gè)稀釋度接種4個(gè)胚或細(xì)胞瓶，37℃孵育72h至7天，檢查雞胚尿囊液的血凝活性或細(xì)胞培養(yǎng)物的血細(xì)胞吸附作用，按標(biāo)準(zhǔn)方法算出中和效價(jià)，不出現(xiàn)血凝活性或血細(xì)胞吸附作用的最高稀釋度即為血清中和抗體滴定。

NT實(shí)驗(yàn)是最敏感而特異的血清學(xué)方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對(duì)應(yīng)、特別是與吸附到宿主細(xì)胞上的病毒表面抗原相對(duì)應(yīng)時(shí)，才能在實(shí)驗(yàn)中取得滿意的顯示效果。因此，某一個(gè)血清型的中和實(shí)驗(yàn)抗體只與同組內(nèi)地其他病原表現(xiàn)出有限的交叉反應(yīng)。由于病毒中和實(shí)驗(yàn)操作煩瑣，耗時(shí)費(fèi)料，臨床上幾乎不用，但作為經(jīng)典方法在病毒鑒定中起著重要的作用，許多新的檢測方法都要以之為標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行比較。