大腸桿菌基因組基因無痕敲除的優化方法

日期：2014-07-28 09:09:09

近幾十年來，大腸桿菌是基因工程、代謝工程和合成生物學等領域的重要工具菌株，是生產重組蛋白、氨基酸、有機酸、能源物質和一些重要化工產品的主力微生物之一。為使大腸桿菌獲得新的性狀和生產能力，基因敲除及基因敲入是構建新型大腸桿菌的重要手段。

目前，一種基于 λ噬菌體的Red同源重組系統是大腸桿菌等原核生物基因組修飾的主要方法，是遺傳育種的有力手段。傳統的Red同源重組方法主要是先用兩端帶同源臂的抗生素基因片段或帶有目的基因和抗生素基因片段替換特異的大腸桿菌基因組基因，再把抗生素基因片段通過重組酶（ flippase，FLPｆ）同源重組去除。但經過這種敲除后的基因組中還殘留一個FRT序列的疤痕，殘留的疤痕限制了再次利用該敲除系統進行進一步基因組改造。因此，一種不留下疤痕的敲除方法已成為近期研究的熱點。

近期來自大連大學醫學院等處的研究人員以無痕敲除大腸桿菌 CLM37基因組nanKETA基因為模型，通過優化同源雙鏈核苷酸的長度和誘導表達篩選酶的誘導濃度，建立了快速高效無痕基因敲除體系，為大腸桿菌基因組改造提供了有效方法。這一研究成果公布在《中國生物工程雜志》上。

現階段，適用于大腸桿菌的無痕敲除方法主要有Red同源重組系統與核酸內切酶I-SceI切割篩選相結合法，兩步Red同源重組系統正負篩選法， Tn5靶向的Cre/loxP切除系統法等。但目前的無痕敲除方法普遍存在如操作步驟較復雜、周期較長、重組率較低等不足。最常用的方法是基于Red同源重組系統和核酸內切酶I-SceI的切割篩選作用，其原理主要通過兩步連續的同源重組實現無痕敲除，即先用帶篩選標記的抗性基因和核酸內切酶I-SceI識別序列的片段敲除目的基因片段；再通過完全與目的基因上下游同源的片段同源重組，依靠誘導核酸內切酶I-SceI表達，切割篩選去除未進行重組的菌株，達到無痕敲除目的。但在第二步同源重組時效率較低，即無痕化處理效率較低，是該技術的主要瓶頸。

在這篇文章中，研究人員以無痕敲除大腸桿菌nanKETA基因簇為模型，利用Red同源重組系統和核酸內切酶I-SceI的篩選作用，通過兩步連續同源重組無痕敲除大腸桿菌CLM37基因組中的nanKETA基因，優化無痕敲除時同源DNA長度與誘導用于篩選陽性克隆I-SceI表達的誘導劑濃度。

通過比較敲除nanKETA基因前后菌株的生長曲線，研究大腸桿菌CLM37缺失nanKETA基因后的生長狀態。結果研究人員成功無痕敲除大腸桿菌CLM37基因組中的nanKETA基因，并在無痕化處理時，通過延長與基因組同源DNA的長度，由通常使用的80堿基對延長到684堿基對；并通過提高誘導篩選基因表達的四環素的濃度，由500 μg/ml提高到1000 μg/ml后，使無痕敲除效率高達90%以上。生長曲線研究表明，缺失nanKETA基因后的菌株生長狀態與原菌株基本一致。

由此研究人員認為通過延長與基因組同源的雙鏈核苷酸的長度和誘導篩選基因表達的四環素的濃度，可顯著提高無痕敲除的效率。

研究人員指出，通過適當延長無痕化處理時使用的雙鏈核苷酸的長度和提高誘導篩選基因表達的四環素的濃度，不僅能使得到的重組菌不攜帶任何抗性篩選標記，達到大腸桿菌染色體基因無痕敲除的目的，還使無痕化處理效率達到 90 ％以上，顯著提高了無痕敲除的效率，縮短了實驗時間，為構建特異基因型微生物和微生物代謝途徑改造的研究提供了一個非常有效的手段。

敲除大腸桿菌中的nanKETA基因，能提高唾液酸合成效率，有利于提高唾液酸的產量。唾液酸是一類9碳單糖的衍生物，在許多生物、病理和免疫識別過程中發揮著重要的作用，如細胞粘附、抗感染、抗病毒、腫瘤轉移等。這一研究利用 λ噬菌體的Red重組系統，成功對大腸桿菌CLM37基因組中nanKETA基因進行無痕敲除，得到nanKETA基因缺失的菌株，為進一步高效生產唾液酸及唾液酸修飾寡糖的研究奠定了基礎。