Nature Methods：?jiǎn)渭?xì)胞western blot

日期：2014-07-10 08:59:15

正如世界上沒(méi)有兩片相同的樹(shù)葉，世界上也沒(méi)有兩個(gè)相同的細(xì)胞。探索細(xì)胞之間的異質(zhì)性，有助于了解復(fù)雜的細(xì)胞世界。為此，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的研究人員開(kāi)發(fā)出一種單細(xì)胞western blot方法，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞分辨率的蛋白質(zhì)分析。這項(xiàng)成果發(fā)表在最新一期的《Nature Methods》雜志上。

異質(zhì)性是細(xì)胞過(guò)程所固有的，包括干細(xì)胞分化、發(fā)育、癌癥、藥效及免疫反應(yīng)等。為了充分了解復(fù)雜細(xì)胞群體中多樣化的行為，研究人員需要一些分析工具，帶來(lái)單細(xì)胞分辨率、提供定量且高度特異的目標(biāo)蛋白檢測(cè)，但又不使用可能干擾細(xì)胞功能的標(biāo)簽。目前的一些方法多存在限制，要么特異性有限，要么反映了細(xì)胞群體而非單個(gè)細(xì)胞的行為。

為此，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校（UC Berkeley）生物工程系的研究人員開(kāi)發(fā)出一種單細(xì)胞western blot（scWestern）方法。具體來(lái)說(shuō)，它采用一塊可擴(kuò)展的開(kāi)放式微孔芯片結(jié)構(gòu)，能在4小時(shí)內(nèi)同時(shí)分析~2000個(gè)細(xì)胞。他們應(yīng)用這種方法來(lái)研究體外刺激下的干細(xì)胞信號(hào)和分化反應(yīng)。

scWestern分析采用顯微鏡玻片，包被有30-μm厚的光敏聚丙烯酰胺（PA）凝膠，而芯片上共有6720個(gè)微孔。這些微孔的直徑為20 μm，是在聚丙烯酰胺凝膠聚合時(shí)形成的。為了實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的同時(shí)分析，scWestern整合了所有關(guān)鍵的western blot步驟。

研究人員稱，三個(gè)基本的設(shè)計(jì)原則支撐了scWestern。首先，在流體、光學(xué)和電子接口方面，他們從整體上解決了scWestern，這實(shí)現(xiàn)了高度平行的分析，而不需要單獨(dú)獲取每個(gè)細(xì)胞。通過(guò)被動(dòng)重力驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞設(shè)置，細(xì)胞懸液接種到微孔中，每個(gè)微孔在5-10分鐘內(nèi)捕獲0-4個(gè)細(xì)胞。

作為第二個(gè)設(shè)計(jì)原則，他們通過(guò)優(yōu)化短分離距離的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），實(shí)現(xiàn)了高密度的scWestern芯片。在細(xì)胞裂解后電泳開(kāi)始，他們?cè)诮](méi)的scWestern玻片上應(yīng)用電場(chǎng)，電泳蛋白穿過(guò)微孔壁，進(jìn)入薄的凝膠層。第三個(gè)設(shè)計(jì)原則利用了反應(yīng)（蛋白質(zhì)固定）和運(yùn)輸（抗體雜交）的小特征長(zhǎng)度。在PAGE之后，蛋白質(zhì)與PA凝膠交聯(lián)。之后進(jìn)行抗體雜交和檢測(cè)。

研究人員應(yīng)用這種scWestern方法來(lái)監(jiān)控大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的單細(xì)胞分化以及對(duì)有絲分裂原刺激的響應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)，scWestern能定量每個(gè)單細(xì)胞中最多11種目標(biāo)蛋白，在與FACS整合時(shí)，支持稀有或珍貴細(xì)胞（~200個(gè)）的分析。