非主流基因表達分析，只屬于勇敢者的游戲
日期：2014-03-12 08:59:58
盡管人們已經對許多生物進行了基因組測序，但對樹蛙和藍莓這些非模式生物的基因組還并不了解。正因如此，在非模式生物中進行基因表達分析，很容易得到新的發現。
目前，小鼠、擬南芥等模式生物的基因組和轉錄組已經被充分測序，各路商家在此基礎上開發了大量商業化芯片、qPCR引物、探針組合和一些其他試劑。這些現成的工具為基因表達分析帶來了很大的幫助。
然而在另一方面，人們研究非模式生物的基因表達時，可以選擇的工具卻比較少。不過，這種障礙并不是無法克服的。在二代測序（NGS）、云計算以及一些軟件的幫助下，所有人都可以成為非主流基因表達研究的專家。
RNA測序
在過去，樹蛙研究者需要通過長時間的實驗來構建EST（表達序列標簽）或cDNA芯片，再利用這些工具捕獲mRNA，最后進行基因表達的分析。如今，RNA-seq可以完美的取代上述技術，美國國家基因組資源中心（NCGR）的研究副主席Callum Bell說。
為RNA-seq實驗做準備其實與制備cDNA文庫差不多，只不過在最后“有人幫你進行測序，就是這么簡單，”北卡羅來納大學的生物信息學和基因組學副教授Ann Loraine說，他正在研究藍莓中的生物活性物質。
不過RNA-seq的成本相對較高，因此Loraine提醒研究者們，要在測序開始前先確定好自己的研究重點，例如研究植物/動物的哪些部分，或者哪些發育階段。
在對轉錄組進行測序之后，我們需要將讀取結果裝配成為轉錄本，并對其加以注釋。對于非模式生物來說，這樣的注釋工作可能比較困難。“我們需要通過可靠途徑來解析轉錄本的功能，”Bell說。NCGR使用的是蛋白模體的隱馬爾可夫模型數據庫（例如TIGRFAM）。人們可以利用這些資源找到開放閱讀框，并將序列翻譯成為氨基酸。獲得了氨基酸序列之后，就可以通過BLASTP等工具在蛋白數據庫（如SWISS-PROT）中尋找同源蛋白。
在過去的日子里，人們需要利用轉錄本構建芯片，以便檢測基因表達的水平和模式。但現在，“倒不如就通過RNA-seq”來獲得上述信息，英屬哥倫比亞大學的計算生物學家Paul Pavlidis說。
為了幫助研究者們理解自己得到的轉錄本，Loraine的實驗室開發了大量的計算工具。舉例來說，他們開發的CressExpress軟件利用了Gene Expression Omnibus數據庫等公共數據源，在輸入給定基因之后，可以查詢同一個基因組中具有類似表達模式的其他基因。此外，Pathway Tools可以幫助人們預測涉及了給定基因的代謝通路。Loraine實驗室還開發了一個被稱為綜合基因組瀏覽器（Integrated Genome Brower）的可視化軟件，該軟件可以幫助人們直觀比對測序讀取的結果。
尋求合作
不是所有的實驗室都擁有擅長NGS或生物信息學的人才。“測序儀器也還沒有那么普及，” Bell說，盡管臺式測序儀（例如Illumina公司的MiSeq和Life Technology公司的Ion Torrent）正在慢慢改變這一現狀。
另一方面，像NCGR這樣的大型核心機構，“已經積累了進行這些復雜實驗的豐富經驗，”Bell說。現在越來越多的測序數據分析，開始采用云計算基礎設施，NCGR自己就在“開發私有的云計算設施，以便為科學家們提供相應的服務，”他說。
目前，許多盈利性機構和非盈利性的核心機構，都能為用戶提供付費的生物信息學服務。有些可能擁有專門的生物信息學團隊，另一些則主要依賴于云計算進行分析。
這些第三方機構可以提交分析報告，幫助我們理解測序數據的含義。不過，別指望他們能將研究結論雙手奉上，因為生物學或臨床問題的最終解讀，還得取決于研究者自身的專業知識。
進行驗證
測序可以幫助我們分析基因在不同情況下的差異性表達，例如成熟果實和未成熟果實，皮膚組織和腸道組織等。不過這只是一種初步分析，我們還需要通過qPCR等技術對數據進行驗證。
Pavlidis指出，初步分析之后的小規模實驗（少于200個基因），就不用繼續進行RNA-seq了，因為成本較低的qPCR在這種情況下更加劃算。
Life Technologies公司的資深產品經理Sundiep Phanse，推薦大家在做qPCR之前，先在該公司的產品目錄里找找有沒有符合要求的產品。據介紹，Life Technologies公司提供了超過一百三十萬預設計的TaqMan assays，“此外你還可以根據自己的需要進行定制”。
Bio-Rad公司的市場經理Sam Ropp提醒大家，不論是購買預設計的產品，還是自行通過Primer3設計引物都應該考慮到自己序列的特點。舉例來說，像單核苷酸多態性、二級結構和可變剪切這樣的變量，會對引物的定位產生影響。
對非模式生物展開研究無疑會遇到各種挑戰，不過只要樹立正確的信念，找到合適的工具和資源，我們就可以收獲只屬于勇敢者的獎勵。
下一篇： 湖南大學PNAS構建新型細胞系
