新技術準確定量罕見的mtDNA缺失
日期：2013-09-09 09:36:02
Fred Hutchinson癌癥研究中心的研究人員近日發現了一種新工具，能夠準確分析與多種疾病和衰老相關的極罕見線粒體DNA缺失。這項成果在線發表于《Aging Cell》雜志上。
mtDNA突變的積累與衰老、神經肌肉疾病和癌癥有著密切的關聯。然而，目前的方法無法準確定量和鑒定新的缺失事件，因其發生頻率非常低，正常組織中每1億個線粒體基因組約有一個缺失事件。為了解決這些限制，研究人員開發出一種基于ddPCR的分析方法，來高分辨率地分析這些罕見缺失。他們將這種方法稱為“數字缺失檢測（Digital Deletion Detection）”，簡稱3D。
文章的通訊作者Jason Bielas博士談道：“研究mtDNA突變是極其困難的，更不用說缺失。我們的3D檢測在特異性、靈敏度和準確性上與傳統方法相比有了明顯的改善。微滴式數字PCR所帶來的通量增加讓分析時間從數月縮短至數天。若沒有這一技術，我們無法獲得這一發現?！?SPAN lang=EN-US>
Bielas博士指的是Bio-Rad的QX100™ ddPCR系統。利用這一系統，研究小組分析了80億個人類腦mtDNA基因組，并鑒定出超過10萬個帶有缺失的基因組。他們發現，與流行的看法相反，大多數mtDNA缺失的增加并不是由新的缺失引起的，而是之前缺失的擴增。他們推測，現有突變的擴增應當是造成mtDNA缺失積累的主要因素。
3D是一個新穎的三步法過程，包括富集帶有缺失的分子；基因組被分成單分子液滴，并通過ddPCR定量；利用新一代測序確定斷裂點。
富集完成后，通過QX100系統調整液滴中的分子濃度，讓大多數液滴不含有突變基因組，而少數只有一個。這一過程允許每個缺失被無偏向地放大，而不會像qPCR那樣引入誤差。
在擴增后，Bielas及他的小組利用ddPCR確定突變分子的絕對濃度。根據液滴熒光和擴增子大小之間的關系，他們能夠鑒定大腦樣品中罕見缺失的大小和復雜性（到底是幾個克隆的擴增，還是大量隨機缺失）。
研究人員認為，3D檢測作為一種重要的新工具，將有助于更好地研究缺失形成和擴增的機制，以及它們在衰老中的作用。而微滴式數字PCR的高通量和高靈敏度也讓Bielas博士的實驗室能夠靶定骨骼肌、腦組織和血液中其他低水平的致病mtDNA缺失。
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