最新綜述：超越5種堿基的DNA測序（二）

日期：2012-06-21 08:27:52

研究顯示自動化末端染色的Sanger測序方法能檢測常見的三種細菌表觀遺傳學標記4-mC, 5-mC和6-mA。DNA模板中的甲基會影響雙脫氧終止法的核苷酸編入，與無修飾的對照DNA樣品數據比較時，會引起熒光示蹤色譜圖的峰值變化。當模板含6-mA時T信號較高，含5-mC時G信號較低，而含4-mC時G信號較高，以此可以區分不同的胞嘧啶修飾形式。該方法已用于檢測幽門螺桿菌、E. coli和腦膜炎奈瑟氏菌中的甲基轉移酶。不過就我們所知，這一方法并沒有廣泛應用于細菌基因組甲基化檢測?？赡苁怯捎谠摲椒ǖ玫降男盘柫考壿^小，且Sanger測序本身通量相對較低。我們也沒有發現應用這種方法檢測其他DNA堿基修飾的嘗試。

第二代DNA測序技術依賴樣品制備階段的DNA擴增，這會造成堿基修飾的損失，并且阻礙了測序手段在檢測堿基修飾上的應用。因此，堿基修飾位點研究主要集中在應用各種樣品前處理技術，間接推測堿基修飾的存在。通過重亞硫酸鹽測序，第二代測序被廣泛用于檢測5-mC的豐度和動態調控。此外有文獻描述了一種應用MspJI家族限制性內切酶的方法。這種酶識別DNA中的5-mC或5- hmC，并在堿基修飾的上游12個堿基和下游16個堿基處切割一個短DNA片段。提取這些片段進行第二代測序，就能確定基因組中堿基修飾的位點。這種酶對于胞嘧啶修飾側面的不同堿基有偏好，因此在建立全基因組修飾圖譜時會造成偏頗。重亞硫酸鹽和MspJI介導的測序目前都無法區分5-mC 和5-hmC。

科學家為了檢測其他堿基修飾，采用了針對特定修飾的富集方法。Pull-down方法利用抗體或修飾特異性結合蛋白選擇性富集含堿基修飾的DNA片段，并進行高通量的DNA第二代測序，在測序片段上至少存在一個堿基修飾就能被檢測到。然而，這種方法并不能得到確切修飾位點和哪條DNA鏈被修飾的信息。有文獻描述了5-hmC DNA的不同富集方法，以及用于檢測堿基J在基因組分布的anti-J抗體富集方法。

檢測DNA修飾的新興測序方法

將DNA測序靈敏度推至分析極限，并能得到單個DNA分子序列的新技術引起了科學家的廣泛興趣。開發這種新技術的動力之一，就是希望應用測序技術讀取DNA堿基修飾信息。研究人員已采用了多種不同技術進行這方面的研究，有些技術已經商業化。

Helicos Biosciences的商業化技術采用在第二代測序基礎上產生的gated sequencing-by-synthesis進行單分子測序。該技術結合DNA聚合酶和熒光標記技術，單獨的DNA分子在一次一個堿基的延伸過程中能同時被檢測到，檢測步驟后末端基團被移除。該技術并不需要目標DNA的擴增，測序的成功依賴于在成像前DNA鏈上核苷酸的完全編入，所以可能難以找到一種方法能使該技術直接對DNA模板中的堿基修飾敏感。有文獻報道科學家結合一種5-hmC特異性富集方法，應用該技術對胚胎干細胞中5-hmC DNA片段成功進行了全基因組作圖。不過很可惜，Helicos Biosciences目前面臨關閉，能否過關尚未可知。