最新綜述：超越5種堿基的DNA測(cè)序（一）
日期：2012-06-21 08:27:15
DNA測(cè)序已經(jīng)為科學(xué)家提供了豐富的關(guān)于生物系統(tǒng)的信息，不過(guò)迄今為止的研究大多集中在對(duì)基因組DNA序列和重亞硫酸鹽處理后的堿基序列進(jìn)行比較，分析四種標(biāo)準(zhǔn)堿基和5-甲基胞嘧啶。研究顯示核苷酸的許多其他化學(xué)修飾也控制著基本生命功能，能影響病原體毒力，并與多種疾病相關(guān)。而這些修飾不能通過(guò)傳統(tǒng)測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)。在此背景下，本綜述著重介紹了一些新興的具有直接檢測(cè)多種DNA堿基修飾類型潛力的單分子測(cè)序技術(shù)，文章發(fā)表在Current Opinion in Structural Biology雜志上。
基因組和轉(zhuǎn)錄組的堿基排列決定了所有生物的遺傳藍(lán)圖和細(xì)胞特征，因此核酸測(cè)序是研究生物系統(tǒng)最重要的技術(shù)之一。二十世紀(jì)六十年代末期科學(xué)家實(shí)現(xiàn)了在群體中對(duì)同一DNA分子的4種標(biāo)準(zhǔn)堿基序列進(jìn)行解碼，并且通過(guò)Sanger測(cè)序發(fā)展了一種高通量的自動(dòng)化技術(shù)。隨后，第二代測(cè)序技術(shù)以更低的成本提供了更高的DNA測(cè)序通量，盡管該技術(shù)以犧牲讀長(zhǎng)為代價(jià)。最近新興的單分子測(cè)序方法，有望為科學(xué)家提供極長(zhǎng)的DNA測(cè)序讀段，更快的測(cè)序速度，更少的測(cè)序前處理步驟，和更強(qiáng)的分析復(fù)雜異構(gòu)DNA混合物的能力。
DNA除了攜帶基本遺傳信息以外，還含有表觀遺傳學(xué)修飾信息。表觀遺傳修飾現(xiàn)象出現(xiàn)在包括病毒和噬菌體的幾乎所有生物體內(nèi)。這種修飾隨著空間（生物體不同組織和細(xì)胞類型）和時(shí)間（生物體生命周期的不同階段）的不同而變化，大大擴(kuò)展了DNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和信息含量。在高等真核生物中，最常見(jiàn)的表觀遺傳標(biāo)記是5-甲基胞嘧啶(5- mC)，5- mC 是DNA 復(fù)制后DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生的。5-mC能影響基因表達(dá)、基因組印跡、轉(zhuǎn)座因子抑制和X染色體失活，是生長(zhǎng)和發(fā)育所必須的，并且涉及多種疾病（包括自閉癥和結(jié)腸癌）。5-mC測(cè)序通常要經(jīng)重亞硫酸鹽的化學(xué)處理，將所有胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶只留下5-mC不變，隨后對(duì)DNA產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增將尿嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶T。已有多篇文章對(duì)該方法和其他基于芯片的非測(cè)序方法進(jìn)行了綜述。也有文獻(xiàn)對(duì)不同重亞硫酸鹽方法的優(yōu)劣進(jìn)行了詳細(xì)比較。
雖然針對(duì)基因組中4種標(biāo)準(zhǔn)堿基以及5-mC（通過(guò)重亞硫酸鹽測(cè)序）的測(cè)序技術(shù)不斷進(jìn)步，在速度和效率上不斷增加，成效顯著，但是對(duì)DNA其他重要化學(xué)修飾形式進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)的方法卻發(fā)展得格外緩慢。在此背景下，我們總結(jié)了現(xiàn)有的DNA化學(xué)修飾知識(shí)，回顧了獲得這些信息的方法技術(shù)，并著重強(qiáng)調(diào)了能檢測(cè)DNA堿基修飾的新興測(cè)序方法。
DNA有很多種重要的功能性修飾（圖1）。除了5-mC以外，在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還檢測(cè)到了5- mC被Tet酶家族氧化形成的5-羥甲基胞嘧啶 (5-hmC)，且5-hmC與胚胎干細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育和致癌作用相關(guān)。重亞硫酸鹽處理方法能檢測(cè)5-hmC，但不能將其與5-mC區(qū)分開(kāi)。最近在小鼠胚胎干細(xì)胞和器官中發(fā)現(xiàn)了5-甲酰胞嘧啶 (5- fC),和5-羧基胞嘧啶 (5-caC)，這使胞嘧啶的化學(xué)修飾形態(tài)總數(shù)增加為4種，并且引發(fā)了人們對(duì)是否還存在其他胞嘧啶表觀遺傳學(xué)形態(tài)的興趣。另有研究發(fā)現(xiàn)在原生生物、植物和蚊子中存在N6-甲基腺嘌呤(6-mA)，有間接證據(jù)顯示6-mA在哺乳動(dòng)物中也可能存在。研究人員在特定細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)了一些影響特定功能的堿基修飾，如尿嘧啶在先天免疫和適應(yīng)性免疫中起重要作用，β-D-吡喃葡萄糖氧甲基尿嘧啶（base J)在某些寄生原生動(dòng)物（如錐蟲(chóng)）中影響基因調(diào)控和端粒功能，核糖核苷在酵母細(xì)胞周期中印記酵母交配型轉(zhuǎn)換。生物通 www.ebiotrade.com
DNA修飾在原核生物中也廣泛存在。細(xì)菌的已知表觀遺傳學(xué)修飾大多數(shù)是限制性內(nèi)切酶目標(biāo)序列的甲基化，作為細(xì)菌DNA抵御病原體入侵的識(shí)別標(biāo)志。這種限制修飾系統(tǒng)的三種最普遍的堿基修飾是，4-甲基胞嘧啶 (4-mC), 5-mC和6-mA，但也存在其他類型的修飾如硫替代磷酸鹽的非橋接氧形成的硫代磷酸修飾。最近幾年，研究人員發(fā)現(xiàn)的限制修飾系統(tǒng)數(shù)量增長(zhǎng)的很快（圖2）。DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（Dam）形成的6-mA，能調(diào)控細(xì)胞周期和DNA復(fù)制、復(fù)制后錯(cuò)配修復(fù)、基因表達(dá)調(diào)控、相變轉(zhuǎn)換phase variation switching和致病性等基本細(xì)胞功能。在E. coli中DNA胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶（Dcm）催化的5-mC會(huì)降低穩(wěn)定期核糖體蛋白基因的表達(dá)。
除了酶促反應(yīng)介導(dǎo)的有益堿基修飾，DNA損傷也能造成DNA改變。DNA在內(nèi)源和外源因素造成的持續(xù)壓力下，堿基的化學(xué)穩(wěn)定性有限，在氧化、烷基化、輻射損傷和水解等不同類型損傷的情況下，DNA容易受到化學(xué)修飾。這些DNA損傷造成的DNA堿基修飾在生物體內(nèi)廣泛存在，并對(duì)生理狀態(tài)和疾病表現(xiàn)有重要影響。例如，氧化損傷的產(chǎn)物，如8-羰基腺嘌呤和8-羥基鳥(niǎo)嘌呤（這兩種氧化產(chǎn)物在線粒體中尤為廣泛存在）與衰老和阿爾茨海默癥、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。有害的烷基轉(zhuǎn)移（如1-甲基腺嘌呤、3-甲基胞嘧啶、O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤、或O4-甲基胸腺嘧啶）與膠質(zhì)瘤和結(jié)腸癌有關(guān)，不過(guò)也能應(yīng)用于化療中摧毀癌細(xì)胞DNA。吸煙、工業(yè)化學(xué)物或紫外照射等環(huán)境因素能導(dǎo)致形成二羥環(huán)氧苯并芘（BPDE）和嘧啶二聚體等大化合物，誘發(fā)肺癌和皮膚癌。電離輻射也能造成DNA堿基損傷（如5-羥基胞嘧啶、 5-羥尿嘧啶、5-羥基胸腺嘧啶或胸腺嘧啶乙二醇），通過(guò)有害自由基生成的直接或間接影響，導(dǎo)致慢性炎癥、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。尿嘧啶、黃嘌呤、肌苷和胸腺嘧啶（通過(guò)5-mC脫氨基）等的脫氨基產(chǎn)物，具有致突變作用并且能導(dǎo)致多種癌癥。基因組DNA在復(fù)制過(guò)程中整合入核糖核苷酸的損傷類型在酵母中高達(dá)0.1%，并與基因組不穩(wěn)定性有關(guān)。
5-mC以外的堿基修飾檢測(cè)技術(shù)大多局限于大型研究方法，如色譜分析、質(zhì)譜分析、電化學(xué)方法、放射性標(biāo)記和免疫化學(xué)分析，或者對(duì)限制性內(nèi)切酶敏感。這些方法一般缺乏確定堿基修飾確切位點(diǎn)和鏈特異性所必須的分辨率。因此急需能直接檢測(cè)堿基修飾的測(cè)序方法。
