限制性內切酶質量控制(Restriction Endonucleases: Quality Control)

日期：2011-08-26 09:53:51

單位定義

限制性內切酶的一個活性單位是指，在50μl 的反應體系里，采用隨酶提供的 NEBuffer，用1個小時的時間，徹底消化1μg底物DNA所需要的酶量。酶切反應應在帶蓋的Eppendorf 管中進行，選用技術數據卡上所標明的適宜溫度。在確定酶活性之前，濃縮的酶應該用推薦的貯存液稀釋成大約1,000 單位/ml。

質量控制

所有質量控制鑒定結果都公布在隨酶提供的技術數據卡上。

非特異性內切酶鑒定

為鑒定非特異性內切酶污染，限制性內切酶與缺少該酶識別序列的超螺旋DNA底物溫育。對于RF I型DNA(超螺旋形式)，一個單一的非特異性缺口就會將它轉變成RF II型DNA(帶缺口環狀)。小份的限制性內切酶與1μgDNA在50μl反應體系中，采用推薦的NEBuffer，在推薦的溫度下溫育4小時。兩種形式的DNA在瓊脂糖凝膠上很容易區分，可以計算出從RF I 到 RF II的轉化率。

核酸酶污染的過夜鑒定

所有的限制性內切酶與1μg 底物DNA在50μl反應體系中，采用推薦的NEBuffer溫育過夜。比較酶切1小時的特征帶型和過夜酶切的帶型。如果兩種情況下帶型均明顯、沒有改變，則說明測試的酶中不存在非特異性的DNA酶。我們報道了可以溫育過夜的最大酶單位數。

核酸外切酶污染鑒定

所有的限制性內切酶與1μg 單雙鏈混合的、3H標記的E.coli DNA (200,000 cpm/μg)在50μl反應體系中，采用隨酶提供的NEBuffer，在推薦的溫度下溫育4小時。通過可溶解的TCA著色，可以計算出反應體系中被標記的DNA的百分比，進而可以顯示出核酸外切酶的污染。該種方法可檢測出的底線是0.05%。

DNA片段的連接

DNA片段通過用每一種限制性內切酶過量消化底物DNA而獲得。這些片段隨后用T4 DNA連接酶連接( 5′ 末端濃度為0.1-1.0 μM)。連接的片段然后用同一種限制性內切酶重切。僅當3′ 和 5′末端都保留完整，連接反應才會發生；而且只有那些識別位點完全恢復的分子才能被重切。切割后正常的帶型說明3′ 和 5′末端都是完整的，而且準備的酶樣品中檢測不到核酸外切酶和磷酸酶。采用PstI的一個例子顯示如下：

藍白斑篩選鑒定

用于克隆的酶還須通過額外的質量鑒定――藍白斑篩選鑒定，以確定經酶過量消化后DNA末端的完整性。該種鑒定方法為：用酶10倍過量消化適當的載體上lacZ基因中單一的酶切位點，連接，轉化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、連接和表達b-galactosidase可以說明克隆后基因是完整的，一個完整的基因產生藍斑，一個不完整的基因(例如，降解的DNA末端)產生白斑。在進行藍白斑鑒定中，所有的限制性內切酶產生的白斑數量不應超過3%。