人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則（二）
日期：2011-08-26 09:51:37
六、經(jīng)修飾的單克隆抗體
為了提高單克隆抗體在治療和體內(nèi)診斷中的作用，常用單抗與毒素、藥物、放射性核素或其它物質(zhì)偶連形成免疫結(jié)合物，或在同一段多胎鏈包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重組蛋白來(lái)獲得。研究者除對(duì)前面提到的有關(guān)未偶連單克隆 抗體（未修飾單克隆 抗體）的要求外，還應(yīng)提供下列內(nèi)容：
（一）免疫結(jié)合物的構(gòu)建
應(yīng)提供構(gòu)建免疫結(jié)合物所用試劑和過(guò)程的詳細(xì)資料，包括：
1、描述與單克隆抗體連接的成分如：毒素、藥物、酶及細(xì)胞因子，包括：所有成分的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、制法、純度及特征。
2、制備免疫結(jié)合物所用化學(xué)試劑的描述，如連接劑和螯合劑。這些資料應(yīng)該包括試劑來(lái)源、制備方法，以及合成或純化時(shí)殘留雜質(zhì)的測(cè)定等內(nèi)容。還應(yīng)提供合成反應(yīng)途徑的圖解，以及與免疫結(jié)合物中所用化學(xué)試劑毒性相關(guān)資料。
3、在確定成品的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)首先確定該原料與抗體的平均結(jié)合率及每個(gè)抗體被結(jié)合部分的數(shù)量，并揭示免疫球蛋白置換數(shù)量、效力和穩(wěn)定性間的關(guān)系。
4、用重組DNA技術(shù)制備的制品（如來(lái)源于轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或微生物培養(yǎng)基，嵌合的、易形的，互補(bǔ)決定區(qū)［CDR］接合的及單鏈Fv抗體，以及重組免疫結(jié)合物）應(yīng)提供構(gòu)建和置備過(guò)程的全部資料。重組免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性應(yīng)認(rèn)真研究。因聚合物形成構(gòu)形改變或變性而減弱了特異免疫反應(yīng)性（如通過(guò)重組Fvs形成"雙抗"）可能導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)的改變和/或與非靶組織結(jié)合。
（二）免疫結(jié)合物的純度
1、應(yīng)采取特殊措施保證抗體盡可能無(wú)外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因這些污染物質(zhì)在構(gòu)建免疫結(jié)合物過(guò)程中，能與核素、毒素或藥物發(fā)生反應(yīng)。
2、應(yīng)規(guī)定最終產(chǎn)品中游離抗體或游離組分的限量。活性中間體應(yīng)被滅活或去除。
（三）免疫結(jié)合物的免疫反應(yīng)性，效力及穩(wěn)定性
毒素或藥物偶聯(lián)至抗體上會(huì)改變其中任一成分的活性。
1、應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ辉u(píng)估偶聯(lián)前后的免疫反應(yīng)性。
2、免疫結(jié)合物非免疫球蛋白成分的活性應(yīng)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候用效力試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行評(píng)估（例如，毒素、細(xì)胞因子或酶等），用于造影的放射性免疫結(jié)合物除外。
3、免疫結(jié)合物構(gòu)建后，應(yīng)確定免疫反應(yīng)性變化的百分率限值，并作為產(chǎn)品規(guī)格的組成部分。
4、應(yīng)通過(guò)在合并的人血清中37℃無(wú)菌條件下孵育，來(lái)檢測(cè)免疫結(jié)合物在體外的穩(wěn)定性。假如所用抗凝劑不會(huì)影響免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性，血漿可以用來(lái)代替血清。經(jīng)過(guò)規(guī)定間隔時(shí)間分析樣品中完整免疫結(jié)合物及分解產(chǎn)物的濃度。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明評(píng)估產(chǎn)品的穩(wěn)定性的條件及所用陰、陽(yáng)對(duì)照。
（四）與放射性核素偶聯(lián)單克隆抗體的特殊問(wèn)題
放免結(jié)合物應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的、嚴(yán)格控制并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法制備。應(yīng)建立檢測(cè)游離同位素、結(jié)合單克隆抗體、標(biāo)記的非免疫球蛋白物質(zhì)的放射性百分率的方法。
1、放射性標(biāo)記單克隆抗體的初始研究用新藥申報(bào)包含連續(xù)3次放射標(biāo)記試生產(chǎn)的分析結(jié)果，應(yīng)證明所制備的產(chǎn)品未改變免疫特異性、無(wú)菌、無(wú)熱原質(zhì)。放射性標(biāo)記試生產(chǎn)應(yīng)由在研究中對(duì)單克隆 抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記及使用試劑的同一組人員進(jìn)行。
2、制備免疫結(jié)合物時(shí)應(yīng)使用放射性藥品及同位素并應(yīng)提供其無(wú)菌及無(wú)熱原質(zhì)的分析證書(shū)及橫向參比的信涵。
3、在標(biāo)記試生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定最終產(chǎn)品中共價(jià)結(jié)合的和游離的同位素的濃度，以及標(biāo)記試劑及其分解產(chǎn)物的殘留水平。
4、應(yīng)描述給每一個(gè)病人應(yīng)用前后進(jìn)行的質(zhì)控試驗(yàn)。
5、適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，應(yīng)檢測(cè)免疫結(jié)合物形成膠體的情況，并對(duì)其進(jìn)行限定。
6、有關(guān)單抗制備中放射性標(biāo)記物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)家關(guān)于放射性藥品規(guī)定。
七、產(chǎn)品穩(wěn)定性
產(chǎn)品穩(wěn)定性應(yīng)滿(mǎn)足臨床方案制定的要求。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)資料可作為產(chǎn)品審批及標(biāo)定用，但不能代替實(shí)際的穩(wěn)定性資料。
（一）應(yīng)制定穩(wěn)定性檢定規(guī)劃，包括在規(guī)定效期全過(guò)程中，每間隔一定時(shí)間進(jìn)行制品的物理化學(xué)完整性試驗(yàn)（如斷裂或聚合），效力試驗(yàn)，無(wú)菌試驗(yàn)，以及水分、pH和防腐劑的穩(wěn)定性測(cè)定。
（二）確保制品生物活性的穩(wěn)定性試驗(yàn)（例如定量體外效率試驗(yàn)）應(yīng)包括廠內(nèi)參比品。如可能在試驗(yàn)的全過(guò)程中只使用一批試驗(yàn)抗原（如：純化的抗原、細(xì)胞或組織）。應(yīng)用定量效力試驗(yàn)使對(duì)生物活性進(jìn)行有意義的比較成為可能。
（三）加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，既將制品儲(chǔ)存在溫度高于常規(guī)儲(chǔ)存溫度后的穩(wěn)定性試驗(yàn)，可能有助于鑒定及建立穩(wěn)定性指示試驗(yàn)。表示穩(wěn)定性的特定參數(shù)應(yīng)通過(guò)對(duì)每一批制品用趨向分析方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
八、臨床前研究
由于生產(chǎn)條件或配方的改變可引起制品生物活性的明顯變化。因此，建議在臨床前研究中所使用的單抗應(yīng)與臨床試驗(yàn)中擬使用的單抗的生產(chǎn)工藝一致。
（一）交叉反應(yīng)性試驗(yàn)
當(dāng)相同或相關(guān)抗原決定簇在人的非預(yù)定的細(xì)胞或靶組織表達(dá)時(shí)，可觀察到抗體與它們結(jié)合。非靶組織結(jié)合可能具有嚴(yán)重后果，特別是使用藥理活性抗體或細(xì)胞毒性免疫結(jié)合物時(shí)。因此，一般在Ⅰ期臨床試驗(yàn)前應(yīng)經(jīng)過(guò)用人組織或細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)性或非靶組織結(jié)合的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。對(duì)于雙特異性抗體，除檢測(cè)雙特異性產(chǎn)品外，還應(yīng)對(duì)每株親本抗體進(jìn)行逐個(gè)評(píng)估。
1、檢測(cè)交叉反應(yīng)性的體外試驗(yàn)
目前，用人細(xì)胞或組織進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)，應(yīng)使用有效的并被確認(rèn)的新技術(shù)（參照1、2、4）。
2、測(cè)定交叉反應(yīng)性的體內(nèi)試驗(yàn)
當(dāng)有適當(dāng)模型時(shí)，單克隆抗體與非靶人組織的交叉反應(yīng)性應(yīng)在動(dòng)物中進(jìn)行一次綜合的體內(nèi)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果，特別是對(duì)具有溶細(xì)胞性的免疫結(jié)合物或具有ADCC活性的抗體，通常要求進(jìn)行更廣泛的臨床前試驗(yàn)，包括用一種以上動(dòng)物超劑量及重復(fù)劑量進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮對(duì)非靶組織的定位。
（二）臨床前藥理學(xué)和毒性試驗(yàn)
1、設(shè)計(jì)單克隆抗體臨床前安全試驗(yàn)是為了預(yù)測(cè)在人體中可能的毒性
評(píng)估在人體中潛在不良反應(yīng)副作用的可能性和嚴(yán)重程度，并可能確定安全初始劑量和逐步提高劑量。有關(guān)單克隆抗體的臨床前試驗(yàn)，包括免疫原性、穩(wěn)定性、組織交叉反應(yīng)性和效應(yīng)功能。
2、動(dòng)物毒理學(xué)研究
當(dāng)設(shè)計(jì)單克隆抗體的毒理學(xué)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮如下：
（1）若被試樣品為未偶聯(lián)抗體，且無(wú)合適的動(dòng)物模型或無(wú)攜帶相關(guān)抗原的動(dòng)物，且與人組織交叉反應(yīng)性試驗(yàn)明顯陰性，則毒理學(xué)試驗(yàn)不是必須的。
（2）動(dòng)物體內(nèi)相關(guān)抗原的性質(zhì)與人體內(nèi)相關(guān)抗原的生物學(xué)分布、功能及結(jié)構(gòu)應(yīng)具有可比性。但是，對(duì)于所用的動(dòng)物模型，不必要求對(duì)單克隆 抗體的抗原密度或親和力絕對(duì)相等。例如，結(jié)合力差異可通過(guò)增加劑量或服藥頻率來(lái)彌補(bǔ)。應(yīng)鑒定動(dòng)物和人之間存在的抗原數(shù)，單克隆 抗體的抗原親和力或?qū)慰寺?/SPAN> 抗體結(jié)合的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)等方面存在的差異。這可以更精確的推斷人用的安全初始劑量,并評(píng)估安全范圍。
（3）對(duì)單克隆抗體通常不要求進(jìn)行常規(guī)誘變性的評(píng)估。
（4）擬給育齡婦女反復(fù)或長(zhǎng)期使用的產(chǎn)品，應(yīng)該用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型進(jìn)行反復(fù)的深入的研究包括致畸試驗(yàn)。
3、藥效學(xué)和動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)
（1）當(dāng)有動(dòng)物模型時(shí)，則應(yīng)盡可能證明藥理學(xué)效應(yīng)與劑量的依賴(lài)性，以及有效劑量的范圍，可以更好地預(yù)測(cè)治療指數(shù)；當(dāng)無(wú)適合動(dòng)物模型時(shí)，則應(yīng)盡可能以人外周血、組織器官等進(jìn)行體外藥效學(xué)研究。當(dāng)有動(dòng)物模型時(shí)，藥代動(dòng)力學(xué)的有關(guān)資料（生物學(xué)分布，半衰期等）可以從動(dòng)物模型中得到；當(dāng)無(wú)適合動(dòng)物模型時(shí)，動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)可以考慮不做，加強(qiáng)臨床試驗(yàn)時(shí)藥代動(dòng)力學(xué)方面的監(jiān)控。
（2）下列方面可以指導(dǎo)藥代動(dòng)力學(xué)幾藥效學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)的選擇：
①最好選擇與人有交叉反應(yīng)或相同靶抗原的動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于僅抗人而未在動(dòng)物模型中表達(dá)的人抗原或外源抗原（細(xì)菌，病毒等）的未偶聯(lián)單克隆抗體，可以不必用缺乏靶抗原的動(dòng)物做試驗(yàn)。
②當(dāng)有抗原結(jié)合資料表明靈長(zhǎng)類(lèi)為最相關(guān)種屬時(shí)，則對(duì)未偶聯(lián)的單克隆抗體的試驗(yàn)采用非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物是適宜的。
③應(yīng)對(duì)使用正常嚙齒類(lèi)動(dòng)物和鼠異源移植模型精確預(yù)測(cè)單克隆抗體在人體的藥代動(dòng)力學(xué)行為的可能性進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估。異源移植模型對(duì)評(píng)估單克隆 抗體與人體內(nèi)腫瘤結(jié)合的能力更有意義。
（3）鼠源抗體對(duì)于小鼠為非免疫原性物質(zhì)，但在人體內(nèi)具免疫原性，這就使得在鼠內(nèi)所得的重復(fù)劑量結(jié)果難以推至擬在人體內(nèi)使用的重復(fù)劑量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"單克隆 抗體將出現(xiàn)相應(yīng)的問(wèn)題，在這種情況下用嚙齒類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行重復(fù)劑量的研究意義不大。
4、用免疫結(jié)合物進(jìn)行的臨床體內(nèi)研究
（1）應(yīng)在體內(nèi)試驗(yàn)免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性
①應(yīng)測(cè)定免疫結(jié)合物中每個(gè)組分在動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布，并且與未偶聯(lián)抗體的分布相比較。
②不同組分的靶組織和他們能引起的潛在的毒性應(yīng)被證實(shí)。
（2
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