使用ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)分析抗體-膜結(jié)合蛋白以及蛋白-脂類物質(zhì)間的相互作用
日期：2011-04-08 08:13:02
介紹：
研究細(xì)胞膜、膜結(jié)合蛋白和抗體間的相互作用以及這些作用的互相影響是藥物研發(fā)中非常值得關(guān)注的事情。膜蛋白和膜相關(guān)蛋白以及多肽類物質(zhì)在很多生物過程中的地位都非常重要，同時(shí)還參與到一些諸如癌癥等疾病的關(guān)鍵信號通路中。因此，膜蛋白正迅速成為下一代藥物靶點(diǎn)分子大類。
ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)基于表面等離子體共振（SPR）技術(shù)，可同步測定36種生物分子間的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和兩種重要的多肽。Amyloid beta （A）肽在阿爾茨海默病的病理改變中起重要作用，而-synuclein肽則存在于帕金森病的病理變化中。通過一張修飾過的ProteOn傳感芯片，我們將Ab與人工膜的結(jié)合動力學(xué)數(shù)據(jù)給測定出來。我們還描述了如何使用ProteOn NLC芯片來捕獲生物素標(biāo)記的和非生物素標(biāo)記的膜蛋白脂質(zhì)體，并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗體的，呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系的相互作用曲線。點(diǎn)擊索取更多技術(shù)資料
圖1. ProteOn XPR36 系統(tǒng)配基-分析物結(jié)合分析的6 × 6陣列格式。A) 6個(gè)ligand 被偶聯(lián)到6條平行的縱向通道中（藍(lán)色）；B) 6個(gè)analyte注入到6條與之前相垂直的通道中（黃色）；C) 單個(gè)ligand–analyte互作位點(diǎn) (綠色區(qū)域)以及2個(gè)位點(diǎn)間參照（黃色）。
實(shí)驗(yàn)1. 使用單層小泡（SUVs）對GLM芯片進(jìn)行修飾并捕獲A和-Synuclein多肽
芯片修飾
傳感芯片表面用50 mM NaOH和8 mM CHAPS分別在橫向和縱向兩個(gè)方向沖洗兩遍，然后縱向連續(xù)注入3針PBS，流速設(shè)為100 µl/min。通道1、3和5用0.05 M sulfo-NHS和0.02 M EDAC活化，條件為30 µl/min，6分鐘。將5 µl Undecylamine（十一胺）和495 l DMSO（二甲基亞砜）混合后用pH 5.0的醋酸鈉溶液稀釋20倍。混合液用移液器吹打混勻，直至澄清。Undecylamine (0.05% v/v) 以30µl/min，注入到通道1、3和5，持續(xù)6分鐘。最后將通道1、3和5用1M 鹽酸乙醇胺去活化，條件是30 µl/min，6分鐘。隨后芯片表面用50 mM NaOH縱向流過芯片以穩(wěn)定基線。
脂質(zhì)捕獲
單層小泡（SUV）的制備是參照前人文獻(xiàn) (Smith et al., 2008)，然后用PBS稀釋到終濃度0.4 mM。SUV在30 µl/min的流速下縱向注入芯片400s。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-choline] (POPC) (0.4 mg/ml)注入通道1和2。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-[phospho-L-serine] (POPS)注入通道3和4。通道5和6流過POPC和POPS的混合物。
Analyte注入
A 蛋白(100 µg)按照已有文獻(xiàn)的描述的制備成終濃度22 µM的PBS溶液。芯片表面用PBS以100 µl/min橫向注入30秒沖洗。沖洗3-4次后A (8.8 µM)或-synuclein (7 µM)以100 µl/min橫向注入，結(jié)合1分鐘，解離10分鐘。測定動力學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)，A蛋白以一系列濃度 (11 µM, 5.5 µM, 2.75 µM, and 1.375 µM) 注入4個(gè)通道，僅留一個(gè)通道注入緩沖液。
芯片表面再生
芯片再生需要去掉脂質(zhì)，用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入芯片，采用短時(shí)脈沖形式，即100 µl/min的流速，18秒。
圖2. 將特定的脂質(zhì) POPC, POPS, 和 POPC/POPS 捕獲在Undecylamine處理過的GLM 傳感芯片表面。
圖3. A 蛋白有選擇性地結(jié)合到用Undecylamine 處理過，并偶聯(lián)了脂質(zhì)POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中；A 蛋白不會被捕獲到未經(jīng)處理的芯片表面。
圖4. -synuclein蛋白有選擇性地結(jié)合到用Undecylamine 處理過，并偶聯(lián)了脂質(zhì)POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中；-synuclein不會被捕獲到未經(jīng)處理的芯片表面。
圖5. A蛋白和OPC/POPS處理過的表面的濃度依賴性結(jié)合曲線。動力學(xué)數(shù)據(jù)來自3次結(jié)合實(shí)驗(yàn)的平均值：ka = 8.5 (± 0.3 ) x 103 M-1s-1; kd = 3.3 (± 0.1) x 10-3 s-1; KD = 407 (± 9) nM。
圖6. 芯片再生后，將脂質(zhì)POPC, POPS, 和POPC/POPS再次捕到undecylamine處理過的GLM 傳感芯片上。通道1，3和5的再生用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入。實(shí)線代表第一次脂質(zhì)捕獲曲線，虛線表示第二次捕獲。點(diǎn)線代表脂質(zhì)注入到未處理過的芯片通道2，4和6。
實(shí)驗(yàn)2. 生物素修飾的脂質(zhì)體捕獲到NLC芯片表面
脂質(zhì)結(jié)合
將含單純皰疹病毒標(biāo)簽的M2肽的低生物素化二肉豆蔻酰磷脂酰（DMPC）膽堿脂質(zhì)體（以色列Weizmann 研究所Shai Arkin 教授惠贈）用緩沖液（PBS）稀釋2倍，然后以25 l/min流速注入垂直方向的1通道，注入2次，共60 l。作為對照，將不含HSV-M2肽的生物素化的脂質(zhì)體和非生物素化的脂質(zhì)體分別注入水平方向的2和3通道。
Analyte注入
將120l 333nM的抗HSV抗體以100l /min流速注入水平通道。
再生
以100l /min流速注入20mM CHAPS，注入1.2分鐘去除脂質(zhì)體和抗體。后續(xù)分析實(shí)驗(yàn)可重新偶聯(lián)脂質(zhì)體和抗體。
圖7. 生物素化脂質(zhì)體捕獲到NLC芯片表面。通道1（藍(lán)色曲線），整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體；通道2（粉色曲線），不含HSV-M2肽的非生物素化脂質(zhì)體（無結(jié)合）；通道3（淺藍(lán)色曲線），不含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體（無結(jié)合）。
圖8 捕獲到NLC芯片表面的含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體與抗HSV抗體的相互作用。左圖，通道中抗HSV抗體與脂質(zhì)體結(jié)合的原始圖線。通道1（藍(lán)色曲線），整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體；通道2（粉色曲線），不含HSV-M2肽的非生物素化脂質(zhì)體（無結(jié)合）；通道3（淺藍(lán)色曲線），不含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體（無結(jié)合）。右圖，抗HSV抗體與整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體的特異性反應(yīng)（以通道2為參照通道）。
圖9. 脂質(zhì)體再生和重新捕獲。
實(shí)驗(yàn)3. 在修飾過的NLC芯片表面捕獲非生物素化的脂質(zhì)體
脂質(zhì)的結(jié)合
為了避免使用囊泡，將生物素化的雙棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)加入到含有10% DMSO的運(yùn)行緩沖液中，在垂直方向上以25 l/min的流速注射180 l到通道1和通道2，將含有HSV-M2多肽的非生物素化的脂質(zhì)體以25 l/min的流速注射100 l到通道1，通道2作為空白參照。
Analyte的注入
抗HSV的抗體分別以10, 5, 和2.5 nM三個(gè)濃度，100 μl/min的流速，水平注射250μl。
再生
將20 mM Tween 20或20 mM CHAPS以25 μl/min的流速注射30 μl可以除去脂質(zhì)體和抗體。再生后，按照上述方法重復(fù)注射過程，可將脂質(zhì)體重新捕獲到NLC芯片表面。
圖10. 抗HSV的抗體(10, 5, 和2.5 nM)與嵌入到NLC芯片表面脂質(zhì)體中的HSV-M2多肽的相互作用。
結(jié)論
• ProteOn XPR36蛋白相互作用系統(tǒng)提供了操作簡便、低成本的方法，便于研究膜-蛋白之間和膜蛋白-抗體之間的相互作用。
• 這些相互作用能通過ProteOn 系統(tǒng)的6*6陣列采用高通量的方式進(jìn)行測定。
• 源于 POPC 和 POPS 的單層小泡（SUV）能夠被反復(fù)地捕獲到修飾過的ProteOn GLC芯片上，Aβ 多肽和 α-synuclein 多肽的結(jié)合程度亦能測定。
• 能測定Aβ 多肽與芯片上捕獲的POPC/POPS SUV 表面的結(jié)合動力學(xué)。
• 含有HSV標(biāo)簽的 M2 多肽的脂質(zhì)體，不管是生物素化與否，都可以反復(fù)結(jié)合到ProteOn NLC芯片上，重復(fù)性很好。
• 抗HSV標(biāo)簽的抗體和嵌入到脂質(zhì)體中的M2多肽的相互作用也能被檢測到。
• ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)是個(gè)強(qiáng)大的工具，可以用于研究膜和膜相關(guān)蛋白、多肽、抗體的相互作用。
參考文獻(xiàn)
Smith DP et al. (2008). Formation of a high affinity lipid-binding intermediate during the early aggregation phase of alpha-synuclein. Biochemistry 47 (5), 1425–1434.
Tew DJ et al. (2008). Stabilization of neurotoxic soluble beta-sheet-rich conformations of the Alzheimer’s disease amyloid-beta peptide. Biophys J 94 (7), 2752–2766.
