如何解決技術(shù)難題 且看五個(gè)科學(xué)實(shí)例
日期：2011-01-11 12:03:16
隨著對(duì)細(xì)胞生理研究的逐漸深入，科學(xué)家們開(kāi)始解析單個(gè)細(xì)胞的行為，這是因?yàn)榧词故峭瑯拥倪z傳物質(zhì)，同樣的周邊環(huán)境，這些細(xì)胞還是會(huì)朝著不同的方向發(fā)展，有時(shí)還會(huì)生成不同的功能，而且單個(gè)細(xì)胞的變化還關(guān)系到癌癥，神經(jīng)疾病等疾病。
然而要分析單個(gè)細(xì)胞，卻不是那么容易的事情，在基因表達(dá)分析中占據(jù)主要位置的DNA芯片這種分析方法，由于靈敏度不夠，所以不足以發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞水平上的差異，但是從單個(gè)細(xì)胞中挑選少量RNAs，或者蛋白也不容易做到，而且如果還要分析細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)因素，那就不只是繁瑣實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題，還需要物理學(xué)，機(jī)械學(xué)，和生物學(xué)的多方配合。為了解決這些問(wèn)題，五位科學(xué)家分別采用了不同的方法，為研究人員提供了新思路。
如何觀察單細(xì)胞在復(fù)雜信號(hào)系統(tǒng)中的應(yīng)答
來(lái)自斯坦福大學(xué)的單分子研究專(zhuān)家Stephen Quake研究組在單分子實(shí)驗(yàn)中也遇到了相同的問(wèn)題，他們希望能檢測(cè)相同細(xì)胞對(duì)于相同信號(hào)的反應(yīng)，之前研究人員已經(jīng)利用定量PCR進(jìn)行了批量分析，但是他們還是希望能就單個(gè)細(xì)胞如何對(duì)不同濃度的信號(hào)分子TNF-α產(chǎn)生相應(yīng)的響應(yīng)進(jìn)行分析。
細(xì)胞信號(hào)交流調(diào)控著基本的細(xì)胞活性以及人體中相應(yīng)的細(xì)胞活動(dòng)。細(xì)胞準(zhǔn)確應(yīng)答周?chē)h(huán)境的能力是發(fā)育、組織修復(fù)和免疫的基礎(chǔ)。深入理解細(xì)胞間的相互交流將有助于了解生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，或能開(kāi)發(fā)出癌癥，糖尿病及其他自身免疫疾病的新療法。
因此Quake研究組研發(fā)了一種新方法來(lái)觀察單一細(xì)胞在細(xì)胞信號(hào)復(fù)雜系統(tǒng)中的應(yīng)答反應(yīng)，這種方法就是高通量的微流體細(xì)胞培養(yǎng)(high-throughput microfluidic cell culture)，將這一技術(shù)與熒光顯微鏡，定量基因表達(dá)分析和建立數(shù)學(xué)模型等研究手段結(jié)合起來(lái)，Quake研究組首次發(fā)現(xiàn)相同細(xì)胞之間存在大范圍的差異，并且指出了科學(xué)家的一些認(rèn)識(shí)可能已經(jīng)被基于細(xì)胞群體研究的結(jié)果所誤導(dǎo)。
細(xì)胞活化這一結(jié)果是一樣的，然而細(xì)胞達(dá)到結(jié)果的過(guò)程可能是不一樣的，群體研究不能顯示信息錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的差異，而這在單一細(xì)胞水平中可以觀察到。
研究人員利用不同的蛋白濃縮物刺激細(xì)胞，這些濃縮物是免疫系統(tǒng)應(yīng)答炎癥或癌癥反應(yīng)的代表性物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一些細(xì)胞接受信號(hào)并被激活，而一些細(xì)胞則沒(méi)有激活。研究人員人員觀察到細(xì)胞以不同的方式產(chǎn)生應(yīng)答，但是細(xì)胞的基本反應(yīng)在許多方面是一致的。
這種方法的優(yōu)勢(shì)是效率十分高——利用這種方法，研究人員能同時(shí)處理成百上千的細(xì)胞，并且觀察長(zhǎng)達(dá)4天的時(shí)間里，這些細(xì)胞的反應(yīng)。而缺點(diǎn)就是微流體實(shí)驗(yàn)并不容易操作，因此一定要考慮清楚。如果你希望觀測(cè)細(xì)胞對(duì)于一個(gè)信號(hào)刺激的反應(yīng)，那么也許一個(gè)96孔板就能搞定，但是如果你希望了解細(xì)胞在系列環(huán)境中的反應(yīng)，那么微流體實(shí)驗(yàn)也許更加合適，具體來(lái)說(shuō)還得看個(gè)人的情況。
如何分析單細(xì)胞不同時(shí)間基因表達(dá)的細(xì)微差別
來(lái)自加州大學(xué)歐文分校H. Kumar Wickramasinghe教授研究組希望能驗(yàn)證基因異常表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞變成癌癥干細(xì)胞這一理論，因此需要分析單個(gè)細(xì)胞生命周期中不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，基因表達(dá)的細(xì)微差別。
在這項(xiàng)研究中，Wickramasinghe教授采用了一種新方法來(lái)處理mRNA，這種方法主要借助于一種十分精巧，稱(chēng)為介電納米探針（dielectrophoretic nanoprobes，生物通譯）的探針，這種探針表面帶有特異性mRNA的引物。當(dāng)這種探針的針尖（20nm）通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電場(chǎng)，吸引細(xì)胞核內(nèi)的分子，這樣探針收回來(lái)的時(shí)候，研究人員就能計(jì)算這一mRNA選擇性“釣”到的分子，比如在Wickramasinghe教授這一實(shí)驗(yàn)中，就是癌基因表達(dá)相關(guān)的分子。
Wickramasinghe教授認(rèn)為這種方法中細(xì)胞不會(huì)死亡，從而研究人員之后還能向其注入試劑，讓這一基因沉默，一個(gè)星期之后又能實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的具體變化了。
這一方法的優(yōu)點(diǎn)就是相對(duì)于其它基因組分析方法，這一方法不會(huì)破壞細(xì)胞，能進(jìn)行進(jìn)一步分析，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程時(shí)間短——整個(gè)過(guò)程大約只需要幾分鐘。缺點(diǎn)就在于這些細(xì)胞必需是自然貼壁的，如果像成纖維細(xì)胞那樣，就要增加一步步驟進(jìn)行處理。不過(guò)Wickramasinghe教授提出也許可以在浸泡在一種細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)物中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。
如何提高檢測(cè)靈敏度
來(lái)自維吉尼亞州大學(xué)，伊利諾斯大學(xué)的研究人員在單細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究方面就遇到了這種問(wèn)題：細(xì)胞在移動(dòng)過(guò)程（包括相互黏連，或者到細(xì)胞外基質(zhì)中去）中需要借助分子力前進(jìn)或者后退，研究人員希望能分析單個(gè)細(xì)胞中的這種機(jī)械力。
維吉尼亞州大學(xué)的Martin Schwartz教授研究組為此發(fā)明了一種傳感器，這種生物傳感器能在活體中測(cè)量蛋白所承受力，研究人員利用這一傳感器發(fā)現(xiàn)了粘著斑蛋白承受力的奧秘。
細(xì)胞對(duì)物理力量做出響應(yīng)的能力對(duì)于發(fā)育和生理來(lái)說(shuō)都是根本性的，包括血液、細(xì)胞粘附和遷移的調(diào)控。難以對(duì)活體細(xì)胞中的分子力進(jìn)行測(cè)量的難度限制了對(duì)此現(xiàn)象的研究。
新開(kāi)發(fā)的這種傳感器就是一種基因編碼的熒光張力感應(yīng)模塊，該模塊能夠在活體中測(cè)量穿過(guò)特定蛋白的機(jī)械力。研究人員利用這種傳感器對(duì)粘著斑蛋白進(jìn)行了測(cè)試——粘著斑蛋白是一種膜-細(xì)胞骨架蛋白，它被吸引到粘著斑上，并將細(xì)胞粘附分子（整合素）與肌動(dòng)蛋白細(xì)絲相連。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)粘著斑蛋白承受力的能力決定粘著斑在力的作用下是整合還是分解。
這種新型生物傳感器應(yīng)能應(yīng)用于力傳導(dǎo)中所涉及的其它蛋白，主要優(yōu)點(diǎn)就是能精確的分析涉及的機(jī)械力，而且靈敏度高，比一般方法的靈敏度至少高100倍，也能用于檢測(cè)細(xì)胞膜表面變形情況。缺點(diǎn)就是蛋白接觸傳感器會(huì)改變蛋白的功能，因此研究人員需要花費(fèi)較多的時(shí)候嘗試。
如何簡(jiǎn)單快捷觀測(cè)磷酸化蛋白
來(lái)自東京大學(xué)干細(xì)胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究室Hiromitsu Nakauchi教授希望能了解干細(xì)胞增殖和重編程過(guò)程中的分子級(jí)聯(lián)信號(hào)，因此他分析了造血干細(xì)胞中蛋白磷酸化造成的影響。
在這項(xiàng)研究中，Nakauchi教授采用了一種簡(jiǎn)單的免疫染色技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞磷酸成像分析（single-cell imaging of phosphorylation assay，SCIPhos）。首先將大約50個(gè)細(xì)胞想排列在載玻片上，然后進(jìn)行染色，通過(guò)共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，通過(guò)這些染色了的磷酸化修飾蛋白，Nakauchi教授可以了解哪些蛋白處于活性狀態(tài)，哪些蛋白失活了，以及這些蛋白的位置。Nakauchi教授說(shuō)，“我的一些學(xué)生也利用這個(gè)方法來(lái)做Western Blotting”。
這種SCIPhos方法的優(yōu)點(diǎn)就是不僅僅能觀察磷酸化蛋白，而且能分析蛋白的位置，這有利于揭示關(guān)鍵的生物信息。缺點(diǎn)就是每個(gè)細(xì)胞需要單個(gè)成像，如果需要處理上千個(gè)細(xì)胞，那就是一個(gè)繁重的實(shí)驗(yàn)了。因此這個(gè)方法比較合適分析少量的細(xì)胞，其中的小技巧就是要多注意防止水分蒸發(fā)，Nakauchi教授就是采用的在細(xì)胞液滴的周?chē)米杷P（water-repellent pen）繞著畫(huà)一圈，這樣液滴就不會(huì)干燥得太快。
如何實(shí)時(shí)觀測(cè)RNA運(yùn)動(dòng)
來(lái)自愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的細(xì)胞生物學(xué)教授Robert Singer希望能了解mRNAs通過(guò)細(xì)胞核核孔中進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的具體過(guò)程，但是傳統(tǒng)的顯微技術(shù)并不能實(shí)時(shí)追蹤到這個(gè)過(guò)程，因此Singer教授想出了一個(gè)新方法，觀察活細(xì)胞中RNA的運(yùn)動(dòng)情況。
首先Singer教授用黃色熒光蛋白標(biāo)記mRNA分子，用紅色熒光蛋白標(biāo)記核孔，通過(guò)高速攝像機(jī)將mRNA分子通過(guò)核孔的過(guò)程拍攝下來(lái)，從而揭示了mRNA分子如何通過(guò)核孔從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的動(dòng)態(tài)機(jī)制。這是研究人員第一次在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)觀察分子的膜孔轉(zhuǎn)運(yùn)。這項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)了與之前認(rèn)知不同的結(jié)果：mRNA迅速地通過(guò)了核孔，緩慢地停泊在細(xì)胞核的邊緣等待釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，具體而言是單個(gè)mRNA分子在到達(dá)核孔后會(huì)等待80毫秒，然后在5毫秒的時(shí)間內(nèi)快速通過(guò)核孔，最后分子在核孔的另一邊又等待80毫秒然后才被釋放到細(xì)胞質(zhì)。
在此之前，顯微鏡的分辨率僅為200nm，這意味著活細(xì)胞中小于這一范圍的分子無(wú)法被分辨。而通過(guò)這項(xiàng)新技術(shù)，研究人員將顯微鏡的分辨率提高了10倍，成功地區(qū)分了大小僅為20nm的分子。
這一方法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)量精度提到了納米級(jí)，缺點(diǎn)是這種成像方法中用到的兩個(gè)相機(jī)拍攝必須完全對(duì)齊，這并不是個(gè)簡(jiǎn)單的工作。
