專家解析單分子細胞分析技術（一）

日期：2010-12-30 08:39:06

隨著對細胞生理研究的逐漸深入，科學家們開始解析單個細胞的行為，這是因為即使是同樣的遺傳物質(zhì)，同樣的周邊環(huán)境，這些細胞還是會朝著不同的方向發(fā)展，有時還會生成不同的功能，而且單個細胞的變化還關系到癌癥，神經(jīng)疾病等疾病。

然而要分析單個細胞，卻不是那么容易的事情，在基因表達分析中占據(jù)主要位置的DNA芯片這種分析方法，由于靈敏度不夠，所以不足以發(fā)現(xiàn)單個細胞水平上的差異，但是從單個細胞中挑選少量RNAs，或者蛋白也不容易做到，而且如果還要分析細胞的動力學因素，那就不只是繁瑣實驗的問題，還需要物理學，機械學，和生物學的多方配合。

來自斯坦福大學的單分子研究專家Stephen Quake研究組在單分子實驗中也遇到了相同的問題，他們希望能檢測相同細胞對于相同信號的反應，之前研究人員已經(jīng)利用定量PCR進行了批量分析，但是他們還是希望能就單個細胞如何對不同濃度的信號分子TNF-α產(chǎn)生相應的響應進行分析。

細胞信號交流調(diào)控著基本的細胞活性以及人體中相應的細胞活動。細胞準確應答周圍環(huán)境的能力是發(fā)育、組織修復和免疫的基礎。深入理解細胞間的相互交流將有助于了解生物系統(tǒng)的復雜性，或能開發(fā)出癌癥，糖尿病及其他自身免疫疾病的新療法。

因此Quake研究組探索出來一種新方法來觀察單一細胞在細胞信號復雜系統(tǒng)中的應答反應，這種方法就是高通量的微流體細胞培養(yǎng)(high- throughput microfluidic cell culture)，將這一技術與熒光顯微鏡，定量基因表達分析和建立數(shù)學模型等研究手段結合起來，Quake研究組首次發(fā)現(xiàn)相同細胞之間存在大范圍的差異，并且指出了科學家的一些認識可能已經(jīng)被基于細胞群體研究的結果所誤導。

細胞活化這一結果是一樣的，然而細胞達到結果的過程可能是不一樣的，群體研究不能顯示信息錯綜復雜的信號網(wǎng)絡中的差異，而這在單一細胞水平中可以觀察到。

研究人員利用不同的蛋白濃縮物刺激細胞，這些濃縮物是免疫系統(tǒng)應答炎癥或癌癥反應的代表性物質(zhì)。結果發(fā)現(xiàn)，一些細胞接受信號并被激活，而一些細胞則沒有激活。研究人員人員觀察到細胞以不同的方式產(chǎn)生應答，但是細胞的基本反應在許多方面是一致的。

這種方法的優(yōu)勢是效率十分高——利用這種方法，研究人員能同時處理成百上千的細胞，并且觀察長達4天的時間里，這些細胞的反應。而缺點就是微流體實驗并不容易操作，因此一定要考慮清楚。如果你希望觀測細胞對于一個信號刺激的反應，那么也許一個96孔板就能搞定，但是如果你希望了解細胞在系列環(huán)境中的反應，那么微流體實驗也許更加合適，具體來說還得看個人的情況。

Quake研究組今年在單分子研究方面還獲得了另外一項重要的成果：他們發(fā)展了一種平價的單分子光譜技術，所謂單分子光譜，其實主要用來研究納米領域，其基本觀念非常簡單：就是一次只觀測一個生物分子或納米粒子，因此可以輕易觀測到很多分子尺度的動態(tài)過程，蛋白質(zhì)分子折迭(folding)即為一例。為了達到單分子光譜的靈敏度，關鍵之一就是要利用高數(shù)值孔徑(numerical aperture, NA)的物鏡來聚焦及收光，然而高NA的物鏡價格相對昂貴，而且還會衍生一些實驗測量上的問題。

為了解決這一問題，以及無法做長時間觀察，觀察視野較小及工作距離較短的問題，研究人員將具有高折射率的二氧化鈦(TiO2)微米球放在單熒光分子及物鏡中間，讓TiO2微米球們扮演微透鏡(microlens)的角色，將熒光分子所發(fā)出的光聚焦至物鏡。這種結合微透鏡及平價低NA(=0.5)物鏡的作法，可偵測單分子訊號而不會有熱效應的問題，因此能做長期觀測。他們利用這項技術成功地在70°C的高溫下，觀察到單一酶的活動過程。