蛋白質純化之親和層析法
日期：2010-09-03 15:54:50
一、儀器設備：
1.親和層析管柱 （Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm）
2.部分收集器 （另需準備干凈試管約25 支）
二、藥品試劑：
1.金屬螯合親和層析膠體（Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210）：1 mL。在交聯瓊脂糖凝膠上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和的。
2.Buffer B-300/0（50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl），使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。
3.Buffer B-300/20：Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
4.Buffer B-300/250：Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole
三、方法步驟：
1.親和層析膠體1 mL 已經裝填在管柱內，成為一淡藍色膠柱。請把管柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，準備注入樣本。
2.除去膠面上方的緩沖液，并取出樣本 （IEX） 使其回到室溫，慢慢用滴管加到親和膠體上，小心勿弄亂膠體表面；讓樣本沒入膠體中，同時收集流出液每管2.5 mL。
3.待樣本全部進入膠體后，關閉出口，再慢慢加入buffer B-300/20，打開出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL。
4.接著以buffer B-300/250 流洗30 mL，方法同上，收集。
5.所有收集均定量蛋白質并測定酶活性，取收集酶活性最高的數個，共得 _______ mL （AF），保留100 μL 以供分析。
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