蛋白質(zhì)純化之離子交換法
日期：2010-09-03 15:54:15
一、儀器設(shè)備：
1.塑料管柱（Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm）
2.部分收集器（fraction collector, 另需準(zhǔn)備干凈試管約60 支）
3.濃縮用離心機(jī)（低速5,000 rpm）及濃縮離心管Centriplus
二、藥品試劑：
1.DEAE Sephacel （膠體體積約15 mL，預(yù)先以緩沖液Buffer A-0 平衡好）
2.Buffer A-0
3.Buffer A-300 溶離液：Buffer A-0 加有0.3 M NaCl
4.Buffer A-500 溶離液：Buffer A-0 加有0.5 M NaCl
三、方法步驟：
1.將Econo-Pac 管柱架好，并將三向閥及軟管等組合完成。
2.震蕩DEAE Sephacel 膠體使其懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢沉降，在沉降過程中隨時(shí)加入buffer A-0，勿使膠體干掉。
3.待膠體沉降完全后，高度應(yīng)在15 cm 左右。膠柱以buffer A-0 一直流洗，流速快慢可以不考慮；連接好收集器，每試管收2.5 mL。離子交換法的膠體平衡極為重要，可測(cè)流出液的pH 或離子濃度，看是否與buffer A-0 相同，若不一樣則需要再流洗的。
4.樣本的添加方法同上述膠體過濾法，并啟動(dòng)部分收集器開始收集，當(dāng)樣本全部沒入膠體后，再加入同體積buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后，去除膠體上方的緩沖液，但勿使膠體干掉。
5.然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶離的，每批次流洗各50 mL，注意更換濃度時(shí)，膠體上方勿殘存上一種溶液。
6.收集所有分劃，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS 活性測(cè)定，結(jié)果作圖。
7.收集GUS 活性區(qū)，并以Centriprep-30 濃縮至 __ mL （IEX），記得要保留100 μL。
8.離子交換膠體以buffer A-0 洗過50 mL 后，收起來交回。
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