中國學者最新文章：基于毒素-抗毒素系統的基因編輯新技術

日期：2017-02-10 09:12:20

高效的基因編輯技術是基礎生物學和生物技術研究的核心技術，在生命科學和生物醫學等領域扮演著日益重要的角色。基于細菌和古菌防御系統建立的高效遺傳操作技術是基因組編輯領域的研究熱點，如利用限制性修飾（RM）系統建立的DNA甲基化模擬系統（MoDMP）和利用規律成簇的間隔短回文重復序列建立的CRISPR技術。

最近發現，毒素-抗毒素系統（Toxin-Antitoxin system）通過利用位于同一操縱子上的毒素和抗毒素基因的編碼產物調節細胞的生長與死亡/休眠，使其適應各種脅迫條件，是原核細胞中普遍存在的一種防御系統。這種能特異調節細胞生長與死亡的機制能夠被應用于細菌DNA克隆、蛋白表達和遺傳操作中。枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）作為一種革蘭氏陽性細菌的模式菌，其遺傳操作系統在各種生理代謝、信號調控以及系統代謝工程等研究中起著重要作用。盡管在芽胞桿菌中已建立了位點特異重組酶介導方法、反篩方法以及CRISPR-Cas9等基因編輯技術，但是革蘭氏陽性細菌的細胞壁結構復雜、細胞抵抗毒性能力強等特點導致遺傳操作的假陽性率高。因而，現有的遺傳操作方法無法高效穩定地對芽胞桿菌等大多數的革蘭氏陽性細菌進行基因編輯。

針對革蘭氏陽性細菌缺乏高效、穩定的無痕遺傳操作系統的這一瓶頸問題，中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室溫廷益研究組和軍事醫學科學院毒物藥物研究所車永勝研究組開展了合作研究，將細菌毒素—抗毒素系統重編程為由抗毒素開關調控的毒素反篩模塊（Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by an Antitoxin Switch, TCCRAS），并經過優化使其適用于枯草芽胞桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等革蘭氏陽性細菌的基因編輯。首先，利用組成型與誘導型啟動子分別啟動毒素與抗毒素基因表達的策略，構建了抗毒素開關調控的毒素反篩模塊（TCCRAS）；通過篩選五種不同來源的II型TA系統獲得了一個高效的反篩模塊relBE，并構建了攜帶TCCRAS系統的遺傳操作載體。利用該系統可以在枯草芽胞桿菌中高效實現了功能基因的缺失、插入、替換、精確點突變與大片段DNA的插入與刪除（最高達194.9kb），并通過插入Pspac-crtI-crtE-crtB操縱子，首次在枯草芽胞桿菌中實現了番茄紅素的生物合成。

此外，可以利用該系統進行谷氨酸棒桿菌染色體基因的無痕敲除、替換及高達179.8kb片段的刪除，反篩與突變效率分別為100%與17.9-85.9%，明顯高于傳統的SacB系統。利用該方法成功地構建了直接發酵法產戊二胺的谷氨酸棒桿菌工程菌，為今后利用谷氨酸棒桿菌生產戊二胺奠定了基礎。

這一研究通過構建抗毒素開關調控的毒素反篩模塊，成功建立了一種新型的基因編輯技術，在革蘭氏陽性細菌中實現了染色體基因的無痕敲除、敲入、替換、點突變及大片段刪除和插入。TCCRAS方法具有不引入任何標記、遺傳穩定、效率高、用途廣等優點，其可作為一種有效的遺傳操作工具用于系統生物學及合成生物學研究；同時，該方法還能夠在基因組水平高效地實現對多種革蘭氏陽性細菌的代謝工程改造，為人工設計構建高效的細胞工廠和新型的生物催化劑，實現重要化合物的生物合成提供技術平臺，提升微生物在醫藥、農業、工業等多個領域中的應用價值。

這一研究進展已于近日在線發表于ACS Synthetic Biology，中科院微生物所博士生吳杰與鄧愛華副研究員為該文的第一作者，溫廷益研究員與車永勝研究員為通訊作者。該研究得到國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2014AA021203）、國家自然科學基金（31570083和31170103）、中國科學院科技服務網絡計劃（STS計劃）（KFJ-EW-STS-078）和中國科學院重點部署項目（KGZD-EW-606）的資助。