簡單兩步改善WB中膜蛋白的檢測
日期：2016-11-17 09:06:45
俄羅斯科學(xué)院的研究人員近日開發(fā)出一種簡單的方法，可改善免疫印跡中膜蛋白的檢測。他們在新一期的《BioTechniques》上介紹了這個成果。
利用Western blot，人們可精確鑒定復(fù)雜樣品中的特定蛋白質(zhì)。然而，每條泳道可加入的蛋白總量是有限的，這就限制了低豐度蛋白的檢測。因此，低豐度蛋白需要預(yù)先富集，才能可靠檢測。為此，研究人員設(shè)計了一種簡單方法，從酵母細胞裂解液中富集膜蛋白，并制備SDS凝膠電泳的樣品。
為了確定漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中膜蛋白Pho87的水平，研究人員一開始用了常規(guī)的方法進行樣品制備。這就是大家熟知的：用玻璃珠破碎細胞，再用Laemmli SDS凝膠電泳緩沖液煮沸細胞裂解物。盡管每條泳道的上樣量相當高，但全長Pho87的條帶卻總是無處尋覓。相反，Pho87降解產(chǎn)物的條帶卻格外顯眼。
由于Pho87是膜蛋白，研究人員便試著通過分離裂解液中的膜組分來濃縮。他們假設(shè)，在細胞破碎過程中提高鹽濃度可保護Pho87免于降解，并刺激膜組分沉淀，從而有助于Pho87的富集。基于此，他們嘗試了不同濃度的乙酸銨和不同的孵育時間，發(fā)現(xiàn)在1 M乙酸銨中孵育2小時可明顯改善Pho87的沉降。
大家都知道，樣品煮沸可能引起膜蛋白的聚集。同時，樣品裂解液中SDS的存在可能使蛋白更容易被蛋白酶水解。事實上，即使蛋白酶抑制劑存在，研究人員還是無法在細胞裂解液中檢測到全長的Pho87條帶。為了避免煮沸并確保蛋白酶迅速降解，他們采用了包含SDS和高濃度尿素的樣品緩沖液。
利用這種方法，研究人員檢測了漢遜酵母的一些蛋白，包括Pho87、Sup35、Pmr1、CPY、Gas1、Tpd3和微管蛋白，以及釀酒酵母的一些蛋白，包括Sup35、Sup45、Gas1、Hsp104、Rnq1和微管蛋白，并將實驗結(jié)果與常規(guī)方法進行了比較。
他們發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)方法相比，新方法在膜相關(guān)蛋白（Pho87、Pmr1和Gas1）以及Tpd3和微管蛋白上有著更好的表現(xiàn)。Tpd3和微管蛋白的沉淀可能是由于它們與紡錘體極體的相互作用。同時，Tpd3的相當一部分位于細胞核中，這可能也有助于其沉淀。作者認為，將沉淀的蛋白溶解在含尿素的緩沖液中而不煮沸，大大改善了蛋白質(zhì)的檢測，特別是Pho87。
