單細胞技術讓這些研究成為現實

日期：2016-10-28 08:55:06

如今，細胞群體的平均值數據已不再能夠滿足研究的需求。研究人員開始轉向單細胞來探索基本的生物學。在這一期的《BioTechniques》上，Jeffrey Perkel博士介紹了讓單細胞實驗成為現實的技術。

2015年底，巴西衛生部門和世界衛生組織報告，新生兒中小頭癥的發病率急劇增加。沒過多久，人們就確定了罪魁禍首：寨卡病毒（Zika）。為何這種病毒在成人中的表現是如何溫和，但在新生兒中卻造成災難性的神經畸形。單細胞生物學將告訴我們答案。

走進寨卡病毒

加州大學舊金山分校的Arnold Kriegstein獲得了奧巴馬政府的BRAIN計劃資助，希望能分類人腦中的不同細胞。在發育的大腦中研究基因表達，這不是一個新概念，許多研究團隊已經做過，但是在大塊組織水平。這些研究鑒定出不同區域和不同發育階段的基因表達差異。不過，他們不能提供細胞特異性指紋。

為了創建基因表達的指紋，Kriegstein的團隊與Fluidigm公司合作，利用自動化的微流體平臺 – C1單細胞自動制備系統。C1能夠平行捕獲800個單細胞，然后分離、逆轉錄并擴增，輸出單細胞cDNA。將這種工具應用在大腦組織上，研究人員之后在Illumina的測序儀上進行測序，并利用分層聚類工具來分類，每一類代表一種特定的細胞類型。在最初的演示中，他們收集了600多個細胞的表達譜，并將它們分成四大類。

這些數據對于解析寨卡病毒的發病機理特別有用。其他研究人員則在研究病毒的受體。一名博士后研究人員Alex Pollen注意到，一種潛在的寨卡受體AXL，在放射狀膠質細胞中高度富集。“如果你試圖產生小頭癥，這些正是你想要瞄準的細胞，”Kriegstein表示。其他細胞也表達AXL，包括神經免疫細胞、內皮細胞和眼睛中的某些細胞，但是神經元大多缺乏AXL表達。“你必須逐個細胞地觀察基因表達模式，”他說。“幸運的是，我們一直這么做。”

發現非整倍體

其他的研究團隊在探索單細胞時，也發現了獨到的生物學見解。事實上，單細胞研究的文章數量在急劇增加，從2010年的46篇增長到2015年的332篇。過去的研究僅限于細胞解剖和生理學，但如今研究人員擁有新一代測序儀和質譜儀，能夠拷問單個細胞的分子內容。

然而，這并不是一件簡單的事。單細胞中沒有足夠的DNA或RNA用于直接測序，因此這些大分子首先必須被擴增，這不可避免地讓人擔心擴增偏倚。蛋白質組學和代謝組學研究并沒有這種選擇，因此研究必然會推動儀器發展。當然，在分析單個細胞時，區分真正信號和隨機噪聲也是相當復雜的。

弗吉尼亞大學醫學院的助理教授Michael McConnell正利用單細胞技術來研究大腦中的遺傳變異。十五年前，他及同事利用熒光顯微鏡和染色體繪畫技術，發現哺乳動物大腦中的細胞在基因組水平上并不完全相同。大約三分之一的分裂細胞要么缺失大量的遺傳物質，要么過量，產生遺傳鑲嵌。

如今，McConnell與Salk研究所的Fred Gage合作對110個單細胞進行測序和SNP分析，以便深入研究“體細胞嵌合”的現象。他們發現，大腦中13-41%的細胞含有Mb大小的拷貝數變異，這些重復和缺失小于十五年前描述的非整倍體，但仍有可能影響細胞表型。“這可能改變離子通道組成，進而直接影響生理學，”他說。

長翼的小鼠？

賓夕法尼亞大學Perelman醫學院的James Eberwine是現代單細胞生物學的先驅之一。自八十年代后期以來，他一直在開發和改進在細胞水平上分析基因表達的方法。據Eberwine介紹，單細胞方法提供的信息無疑會被群體水平的信息所掩蓋。他的實驗室已利用這種技術來記錄細胞之間的mRNA豐度差異，捕獲神經樹突中的RNA，這個區域曾被認為缺乏轉錄本。

不過他也強調，這項技術必須謹慎使用。“我想讓人們知道的是，現在開展單細胞分析是相對簡單的，但想要做好，并不簡單。”數據解釋和對照是關鍵。

Rusty Lansford也同意這一點，他是南加州大學和洛杉磯兒童醫院的副教授。與Eberwine合作，Lansford最近轉向單細胞組學，將這些技術與脊椎動物胚胎發育的活細胞成像相結合。他的研究對象是日本鵪鶉。對于這類研究而言，鵪鶉是比小鼠和雞更好的選擇。Lansford稱之為“長翼的小鼠”。

Lansford的實驗室一直在開發鵪鶉發育過程中細胞運動的成像方法。他在一個胚胎所有細胞中利用組成型啟動子表達紅色熒光蛋白，而另一個胚胎利用內皮細胞特異的啟動子表達黃色熒光蛋白，之后將動物雜交。Lansford利用共聚焦或雙光子顯微鏡來觀察發育中的胚胎，看看每個細胞去哪里。

在發育一段時間后，他們切下特異細胞，利用免疫組化鑒定細胞類型，然后測序RNA。盡管數據還沒有發表，但是研究人員利用這種策略來標記原始生殖細胞，發現他們能夠觀察到每個細胞發育過程中的轉錄組變化。這些實驗頗有挑戰性，不過數據分析要困難得多。“我們必須查看某些事件，了解細胞事件的隨機性，”Lansford說。