CRISPR先驅Nature子刊揭示重要機制

日期：2016-09-08 09:10:28

CRISPR是規律成簇的間隔短回文重復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的縮寫。CRISPR與內切酶Cas是一對好基友，細菌依靠它們組成的防御系統對抗外來侵略者。CRISPR-Cas能夠在引導RNA的指引下，靶標并切割入侵者的遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統發展成了強大的基因組編輯工具。該系統使用簡單而且擴展性強，很快便成為了生物學領域最耀眼的明星。

在細菌的CRISPR-Cas適應性免疫系統中，Cas1-Cas2蛋白復合體會捕獲30–40bp的外源DNA，將它們整合到CRISPR的間隔區，形成自己的免疫記憶。如果這種外源DNA再次入侵，細菌就能夠及時將其剪切，從而保護自身安全。外源DNA整合應當是特異性很強的，不然就會損害基因組或CRISPR序列。然而令人吃驚的是，這種活動在體外顯得相當混亂。

加州大學伯克利分校的研究團隊九月五日在Nature Structural & Molecular Biology雜志上發表文章，向人們展示了CRISPR免疫對基因組完整性的保護。這篇文章的通訊作者是著名CRISPR先驅Jennifer A. Doudna。Doudna教授是CRISPR技術的共同開發者，曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”（Breakthrough Prize），是CRISPR專利的有力競爭者。

研究人員發現，釀膿鏈球菌（S. pyogenes）II-A型Cas1–Cas2整合酶通過限制整合第二步來維持特異性。在非CRISPR位點，整合會停在位點中間，使反應能夠逆轉。釀膿鏈球菌的Cas1–Cas2對旁邊的前導重復序列有很高的特異性，能夠識別重復序列的回文末端。這項研究指出，DNA插入位點沒有此前人們以為的那么普遍，這樣可以防止CRISPR免疫適應的毒性，有助于維持基因組的完整性。

加州大學伯克利分校以Jennifer A Doudna為首的研究團隊取得了諸多令人側目的CRISPR研究成果。去年四月Doudna領導的研究團隊在Science雜志上發表文章，為人們揭示了CRISPR-Cmr 復合體結合靶標的具體機制。他們通過冷凍電鏡技術獲得了天然III型Cmr復合體及其與目標RNA結合時的分子結構，獲得了接近原子水平的高分辨率。

去年十月，Doudna及其同事在Nature雜志上發表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶結構域構象狀態直接控制了DNA切割活性。他們通過分子內熒光共振能量轉移（FRET）實驗，鑒定了HNH核酸酶結構域的一種激活構象。研究還證實，一個α-螺旋將HNH的構象改變傳達給RuvC結構域，激活它實現DNA切割。

今年年初，Doudna的研究團隊揭示了CRISPR-Cas9準備剪切DNA時的關鍵分子結構。在CRISPR-Cas系統中，Cas蛋白與小CRISPR RNA（crRNA）形成復合體，切割與RNA互補的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一個典型特征，基因組編輯常用的sgRNA就會和Cas9形成R-loop。為了闡明R-loop的作用，研究人員通過冷凍電鏡獲得了釀膿鏈球菌Cas9 R-loop的高分辨率結構。