CRISPR先驅Cell子刊發表新成果

日期：2016-09-06 09:10:55

細菌利用CRISPR RNA（crRNAs）指導的監視復合體，來靶定要破壞的外源核酸。雖然大多數I型和III型CRISPR系統需要四個或更多的不同蛋白質，才能形成多亞基的監視復合體，但是，I-C型系統只使用三個蛋白質來實現crRNA成熟和雙鏈DNA的靶標識別。

9月1日，Cell子刊《Molecular Cell》在線發表的一項研究中，加州大學伯克利分校的研究團隊表明，上述每個蛋白質都發揮著多重的功能和結構作用：Cas5c切割pre-crRNAs并招募Cas7定位RNA向導，以用于經由Cas8c的DNA結合和解旋。研究人員采用冷凍電子顯微鏡技術，獲得了Cascade/I-C 監視復合體的自由形式和DNA結合形式的重建結構，所揭示的構象變化可使得形成R環，每一條DNA鏈都有不同的定位。這種精簡的I-C型系統解釋了CRISPR通路如何可能進化出結構緊湊，保留其作為RNA引導性DNA捕獲平臺的全部功能。

這篇論文的通訊作者是基因組編輯技術變革的先驅之一Jennifer A. Doudna教授，她曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”（ Breakthrough Prize）（欲戴王冠，必承其重：追尋CRISPR奧秘的女科學家），同時也是CRISPR專利的有力競爭者（CRISPR發明專利究竟花落誰手？）。

Doudna帶領的研究團隊取得了諸多令人側目的CRISPR研究成果。去年十月，Doudna及其同事在Nature雜志上發表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶結構域構象狀態直接控制了DNA切割活性。他們通過分子內熒光共振能量轉移（FRET）實驗，鑒定了HNH核酸酶結構域的一種激活構象。研究還證實，一個α-螺旋將HNH的構象改變傳達給RuvC結構域，激活它實現DNA切割。

今年年初，Doudna團隊揭示了CRISPR-Cas9準備剪切DNA時的關鍵分子結構。在CRISPR-Cas系統中，Cas蛋白與小CRISPR RNA（crRNA）形成復合體，切割與RNA互補的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一個典型特征，基因組編輯常用的sgRNA就會和Cas9形成R-loop。為了闡明R-loop的作用，研究人員通過冷凍電鏡獲得了釀膿鏈球菌Cas9 R-loop的高分辨率結構。

四月份，Doudna團隊在細菌中發現了一種CRISPR相關的非經典Argonaute。Argonaute蛋白是真核生物RNAi的關鍵效應子，它也參與了原核生物的基因組防御。Doudna及其同事證實，CRISPR相關Argonaute具有與眾不同的特異性。

五月份，Doudna團隊在Molecular Cell雜志上發表文章，揭示了CRISPR介導免疫記憶的一個重要機制。已知CRISPR-Cas的外源序列插入受到嚴格調控，整合在CRISPR前導序列（富含AT）的末尾。Doudna及其同事發現，大腸桿菌E. coli獲取外源序列需要蛋白IHF（integration host factor）。IHF結合前導序列并且誘導DNA彎曲，允許Cas1-Cas2整合酶催化外源序列插入。這項研究表明，CRISPR前導序列在外源序列捕獲中起到了重要的作用。