Science子刊：微量小RNA深度測(cè)序技術(shù)分析

日期：2016-06-15 09:08:11

6月10日，國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Science子刊Science Advances在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）吳立剛研究組與上海市計(jì)劃生育研究所施惠娟研究組合作的最新研究成果“Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos”，該研究?jī)?yōu)化建立了適用于微量樣本的小RNA深度測(cè)序（deep sequencing）文庫(kù)構(gòu)建方法，并系統(tǒng)解析了小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中小RNA的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)功能。

目前小RNA深度測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建通常要幾百納克（ng）總RNA，研究配子和胚胎等難以大量獲取的生物學(xué)樣品中的小RNA表達(dá)譜較為困難。該研究通過(guò)優(yōu)化基于連接反應(yīng)的小RNA文庫(kù)構(gòu)建方法，使得總RNA用量降低了幾十倍，僅需要10納克總RNA即可在Illumina測(cè)序儀上實(shí)現(xiàn)對(duì)小RNA的深度測(cè)序，為研究配子、胚胎和各種干細(xì)胞中的小RNA提供了重要技術(shù)支撐。該研究利用優(yōu)化的方法系統(tǒng)解析了小鼠卵子到受精后8細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程中的小RNA動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類(lèi)小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的這三類(lèi)小RNA絕大多數(shù)來(lái)源于卵子，由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著胚胎的發(fā)育，母源endo-siRNA和piRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快，主要發(fā)生在胚胎2細(xì)胞期前后，其中有近20%的miRNA 3’末端被加上了一個(gè)或四個(gè)腺苷酸（A），其降解速率與未被腺苷酸化的miRNA相比明顯減緩，推測(cè)可能3’末端腺苷酸化發(fā)揮了保護(hù)作用，使某些miRNA免于在母型至合子型轉(zhuǎn)化中被快速清除。合子中新表達(dá)的miRNA最早出現(xiàn)在受精卵第一次分裂前，并隨著胚胎的發(fā)育持續(xù)被激活表達(dá)，特別是進(jìn)化保守的miRNA的表達(dá)量迅速上升。研究人員進(jìn)一步結(jié)合小鼠早期胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在卵子到胚胎2細(xì)胞期中幾乎沒(méi)有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8細(xì)胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開(kāi)始逐步恢復(fù)，并對(duì)合子激活表達(dá)的基因有明顯的靶向抑制作用。以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發(fā)育中miRNA的表達(dá)和降解規(guī)律，還發(fā)現(xiàn)了miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控活性隨著胚胎發(fā)育而被動(dòng)態(tài)調(diào)控的現(xiàn)象，對(duì)于理解miRNA在早期胚胎發(fā)育中的功能和機(jī)制具有重要意義。

楊其元、林濟(jì)民、劉淼為該論文共同第一作者，李逸平課題組的李榮紅對(duì)深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析做出了重要貢獻(xiàn)，吳立剛、施惠娟為共同通訊作者。該工作的數(shù)據(jù)收集工作得到生化與細(xì)胞所公共技術(shù)服務(wù)中心分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)的技術(shù)支持，經(jīng)費(fèi)上得到了國(guó)家科技部、國(guó)家基金委和上海市科委的支持。

小鼠卵細(xì)胞和早期胚胎中微量小RNA深度測(cè)序方法原理及其測(cè)序結(jié)果。(A)微量小RNA深度測(cè)序cDNA文庫(kù)構(gòu)建流程圖。(B)小鼠卵細(xì)胞以及早期胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的樣本。(C)不同樣本中小RNA的組成及長(zhǎng)度分布圖。小鼠CD4+ T細(xì)胞(CD4)是體細(xì)胞對(duì)照。