Nature：CRISPR/ Cas9技術助力遺傳研究

日期：2016-04-22 08:51:53

利用一種新方法，Whitehead研究所的研究人員確定了，在全基因組關聯研究(GWAS)中鑒別出的一種非編碼突變是如何促成散發性帕金森病(PD)的。這種方法可用于為其他有遺傳性病因的散發性疾病，如多發性硬化癥、糖尿病和癌癥分析GWAS結果。

Whitehead研究所創始成員、麻省理工學院（MIT）生物學教授Rudolf Jaenisch說：“這真的是第一次我們從GWAS突顯的風險變異，走向從機制及分子水平上了解一種突變導致罹患疾病風險的機制。”

大約90%的帕金森病是散發性的；它是由環境因素和常見遺傳風險因子之間復雜的相互作用所引起。由于科學家們難以分析這些互作，大多數研究將焦點放在罕見的家族性帕金森病上。GWAS是鑒別提高某種特定疾病患病風險的常見突變的一種方法。一直以來GWAS被用于研究散發性帕金森病和其他的一些復雜疾病，但只取得有限的成功。

GWAS類似于有著成百上千X的基因組藏寶圖，X標記出特定條件下可能是風險因子的突變的大概位置。然而，GWAS不能揭示潛在致病突變的具體位置，也不能指出基因組圖譜上的一個X對疾病的貢獻。例如，在散發性帕金森病中，多重GWAS指出α-synuclein基因(SNCA)是患者基因組中最強的風險位點之一，然而GWAS包含的散發性帕金森病患者中這一基因失調機制的信息非常有限。

為了了解攜帶SNCA的同一條染色體上的遠端基因調控元件，是否可以影響α-synuclein的細胞水平，由Jaenisch實驗室資深研究員Frank Soldner領導的一個研究小組，調查了定位在一個假定SNCA增強子中的、兩個GWAS標記的風險變異。他們的結果在線描述在本周的《自然》（Nature）雜志上。

該研究小組利用了CRISPR/Cas9將一些突變編入到同基因型人類多能干細胞中。通過改變一條染色體上的這一遺傳變異，留下了另一條染色體保持不變，充當內部對照。這種方法使得科學家們能夠以高信度檢測非常微細的效應，同時消除掉任何遺傳或表觀遺傳修飾，及在試驗過程中發生的細胞培養相關變異導致的效應。

Soldner說：“我們的方法解決了GWAS一個重要的缺點——利用GWAS生成的關聯，你無法區分基因組中非常靠近的兩種變異之間的效應。這樣的物理接近意味著，當遺傳時它們總是共分離，這就是我們必須獨立地改變和分析每個變異，同時維持基因組其他部分完全不變的原因。”

在將這些細胞分化為神經元后，科學家們注意到SNCA表達發生了改變。盡管一個突變不產生影響，另一個將核苷酸從A轉變為G的突變輕微但顯著地提高了α-synuclein生成。根據Soldner所說，當與家族性帕金森病中增加的α-synuclein生成進行比較時，A-G突變造成的輕度影響在一生中足以提高帕金森病的風險。

為了了解突變影響α-synuclein生成的機制，研究人員鑒別出了結合SNCA的增強子的兩個轉錄因子。當這一增強子不突變時，轉錄因子結合它會抑制SNCA。如果增強子具有G突變，轉錄因子無法結合這一增強子，SNCA激活。

大多數的遺傳疾病都是散發性，由突變組合所引起。

Jaenisch說，這種在SNCA的增強子中鑒別單個點突變的方法，可用于為散發性帕金森病精確找到其他的致病基因，并為其他疾病，包括阿爾茨海默氏癥、癌癥、糖尿病和多發性硬化癥篩查GWAS擊中點。

Jaenisch是干細胞研究領域的權威人物，他是Whitehead研究所的創始人之一，曾經擔任過國際干細胞學會的主席。其在一系列的領域做出了有影響的工作，包括基因敲除小鼠、表觀遺傳學研究、核移植、iPSC等，解決了這些領域幾乎所有的重要問題。

2015年12月，Jaenisch與Whitehead生物醫學研究所的Richard A Young博士合作，構建出了在人類胚胎干（ES）細胞和成體細胞中構成人類基因組三維（3D）結構，并調控了基因表達的DNA環的圖譜。一些基因和調控元件在這一染色體框架內的定位有可能幫助科學家們更好地指導他們的基因組研究，確立突變與疾病發生發展之間的關系。這一成果發布在Cell Stem Cell雜志上。

2015年9月，Jaenisch領導Whitehead研究所的研究人員開發出了一種方法，監測單個細胞中隨著時間推移發生的DNA甲基化改變。這一突破性的研究成果發布在Cell雜志上。

CRISPR/Cas系統可以構建出多個基因精確突變的小鼠，但其效率低下阻礙了生成足夠數量的轉基因小鼠來建立人類疾病模型。通過添加一種抗癌藥物Scr7到遺傳編輯的受精卵中，Jaenisch課題組將CRISPR/Cas的效率顯著提高了19倍。這一重要的成果發表在2015年3月的Nature Biotechnology雜志上。