CRISPR新應(yīng)用：尋找基因調(diào)控元件

日期：2016-01-29 09:05:20

人體內(nèi)所有的組織都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，每一種蛋白質(zhì)都是由人類(lèi)基因組中一段DNA“編碼”的。

但是這些編碼區(qū)僅占基因組的大約百分之1，而分散在基因組中的其他百分之99的序列，參與了調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，或決定哪些編碼區(qū)將被翻譯成蛋白質(zhì)，以及何時(shí)被翻譯。

1月25日在《Nature Biotechnology》雜志發(fā)表的一項(xiàng)研究中，麻省理工學(xué)院（MIT）和哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員描述了一種新的技術(shù)，可系統(tǒng)而有效地在長(zhǎng)的基因組片段中尋找調(diào)控元件。在這項(xiàng)技術(shù)的第一次應(yīng)用過(guò)程中，他們發(fā)現(xiàn)了證據(jù)表明，當(dāng)前人們對(duì)于基因調(diào)控的看法是不完整的。

本文資深作者、麻省理工學(xué)院電氣工程和計(jì)算機(jī)科學(xué)教授David Gifford說(shuō)：“傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是將基因組切成小片段，并探討它們是否足以推動(dòng)基因的表達(dá)。這有兩個(gè)局限性。第一，可能一些事情足以激活基因，但這并不意味著它是必要的。反之亦然：如果有什么事情是必要的，它可能就不是充足的。所以這些實(shí)驗(yàn)確實(shí)沒(méi)有揭示關(guān)于基因組DNA功能的完整故事。”

Gifford補(bǔ)充說(shuō)：“這些實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)問(wèn)題是，它們并不是在天然的背景下完成的。就是說(shuō)，切割的DNA片段并不位于基因組中正常的位置。我們想用一種直接的檢測(cè)法，揭示基因組序列在其原生環(huán)境中的必要性——在細(xì)胞中，它通常位于基因組中經(jīng)常逗留的位置。我們就在它發(fā)揮正常作用的位置突變它。”

該研究的第一作者是Gifford課題組的博士后Nisha Rajagopal。哈佛醫(yī)學(xué)院研究員Richard Sherwood是共同資深作者。了解基因表達(dá)譜分析服務(wù)的詳細(xì)信息

未標(biāo)記的路徑

在最近幾年，在基因組中確定調(diào)控元件的主要技術(shù)，一直是使用所謂的組蛋白標(biāo)記。在細(xì)胞中，DNA通常被裹緊纏繞在組蛋白周?chē)＝M蛋白的末端經(jīng)常有修飾——如乙酰基或甲基原子團(tuán)的添加。

這些修飾是組蛋白標(biāo)記，某些標(biāo)記似乎與基因表達(dá)的抑制或促進(jìn)有關(guān)。生物學(xué)家找到攜帶這些標(biāo)記的組蛋白，切出纏在它們周?chē)?span lang="EN-US">DNA片段，并對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序。當(dāng)他們?cè)诨蚪M圖譜中找到相應(yīng)的序列時(shí)，他們就可以開(kāi)始仔細(xì)地進(jìn)行有針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)，試圖找出調(diào)控元件。

然而，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究人員，已經(jīng)確定了在基因調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因組區(qū)域，但之前這并沒(méi)有與組蛋白標(biāo)記聯(lián)系起來(lái)。Gifford說(shuō)：“科學(xué)總是經(jīng)歷一系列的假設(shè)。在我看來(lái)，這項(xiàng)研究表明，仔細(xì)考慮我們的假設(shè)，是很重要的。它沒(méi)有直接反駁假設(shè)，但在一定意義上，要求我們對(duì)‘對(duì)基因組功能來(lái)說(shuō)什么是必需的’做進(jìn)一步的探索。”

Gifford及其研究小組開(kāi)發(fā)的這項(xiàng)技術(shù)，是CRISPR基因編輯系統(tǒng)的一個(gè)應(yīng)用。CRISPR是一種切割DNA的方法。在這篇新論文中，研究人員對(duì)四個(gè)已知蛋白編碼區(qū)域中的每一個(gè)區(qū)域周?chē)臄?shù)萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)（或DNA字母），進(jìn)行了徹底搜查。

RNA引導(dǎo)

為了定期進(jìn)行切割，研究者設(shè)計(jì)了4000個(gè)引導(dǎo)RNA——將CRISPR切割酶引導(dǎo)到基因組中正確位置的生物小分子。

在實(shí)驗(yàn)中，引導(dǎo)RNA是在細(xì)胞內(nèi)制造的。對(duì)于所有的引導(dǎo)RNA，研究人員構(gòu)建了DNA模板，細(xì)胞可自然吸收。平均而言，每一個(gè)DNA模板在大約1000個(gè)細(xì)胞中顯示出來(lái)。每個(gè)細(xì)胞都將一個(gè)DNA模板精確地轉(zhuǎn)化為引導(dǎo)RNA，這引導(dǎo)著CRISPR切割酶到達(dá)基因組中的特定位置。

在每一個(gè)這樣的位置上，CRISPR酶會(huì)切割DNA。當(dāng)細(xì)胞試圖修復(fù)那些切口時(shí)，修復(fù)部位的DNA序列會(huì)變得混亂。在某些情況下，這種干擾會(huì)阻止細(xì)胞制造相應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而說(shuō)明功能區(qū)域的重要性。

研究人員隨后進(jìn)行了一組實(shí)驗(yàn)，只靶定這些區(qū)域，以確定某些精確序列——其修飾會(huì)中斷蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。在他們調(diào)查的四個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列的每一段序列周?chē)麄儼l(fā)現(xiàn)了大約1000個(gè)堿基對(duì)的片段，它們顯示出強(qiáng)烈的調(diào)控活性的跡象，但這些組蛋白標(biāo)志以前沒(méi)有描述過(guò)。

Gifford說(shuō)，有可能是，這些片段僅存在于一小部分細(xì)胞中，并且，它們實(shí)際上與組蛋白標(biāo)記有關(guān)；確定組蛋白修飾的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，依賴(lài)于整個(gè)細(xì)胞群體的平均測(cè)量值，所以有可能錯(cuò)過(guò)了異常值。Gifford、Rajagopal及其同事正在繼續(xù)調(diào)查這些區(qū)域，來(lái)確定它們當(dāng)中發(fā)生了什么。

新年伊始，CRISPR技術(shù)的新應(yīng)用可謂是如雨后春筍，例如，加州大學(xué)任兵教授帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)，開(kāi)發(fā)了基于CRISPR/Cas9的高通量篩選策略，并由此發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新型增強(qiáng)子。而中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組，則首次利用CRISPR技術(shù)直接調(diào)控內(nèi)源性基因表達(dá)，將胚胎干細(xì)胞分別誘導(dǎo)為胚外滋養(yǎng)層干細(xì)胞和原始內(nèi)胚層細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)早期胚胎細(xì)胞之間的譜系轉(zhuǎn)換，研究結(jié)果發(fā)表于Nature子刊《Scientific Reports》。相信2016年將會(huì)是CRISPR技術(shù)繼續(xù)大放異彩的一年。