我科學家用CRISPR制備基因敲入豬
日期：2016-01-15 09:00:42
目前為止，科學家一直未能制備出可產生種系嵌合體的豬多能干細胞。基于Oct4啟動子的熒光報告系統，可被用于監控多能性，是制備真正的豬多能干細胞的重要工具。1月12日，來自中科院廣州生物醫藥與健康研究院、吉林大學和云南農業大學的研究人員，在國際著名的綜合性學術刊物《PLOS ONE》發表題為“Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering”的學術成果。在這項研究中，研究人員通過CRISPR/Cas9介導的基因組編輯，制備了攜帶Oct4-tdTomato報告基因的基因敲入豬。
轉基因豬在農業和生物醫藥方面都有著廣泛的應用。然而，生殖系有活性的豬多能干細胞（PSCs）目前尚未制備出來，這阻礙了豬模型的遺傳修飾。為了解決這個問題，一種可能的解決辦法是，為豬PSCs生成一種熒光報告系統。
轉錄因子Oct4，又名POU5F1，可維持細胞的多能性，因此，它的表達反映了干細胞多能性。豬的Oct4報告系統之前已有過報道。然而，關于“豬Oct4啟動子的基因組結構”的知識還是有限的；因此，小鼠Oct4啟動子被用來控制EGFP的表達，豬Oct4基因起始密碼子上游（4000 bp）也被用來作為Oct4啟動子。
小鼠Oct4啟動子與豬轉錄調節因子不能很好地相互作用，4000 bp組成型啟動子可能并不包含所有的調控元件。在豬當中，我們可通過隨機地將外源報告載體整合到豬基因組中，構建基于小鼠或豬Oct4啟動子的熒光報告系統。組成型表達載體中Oct4啟動子不完全的監控區域，以及這些載體的不確定的整合位點，可能會影響其調節功能的準確性。此外，拷貝數變化和內源性基因破壞的風險，可能會進一步影響報告基因的表達。將一個報告基因精確插入內源Oct4的框架，可允許內源性啟動子誘導的報告基因表達，而不改變內源性Oct4的表達，從而可提高豬Oct4表達模擬的精度。
將外源基因敲入豬體細胞的基因組中，一直都是極為困難的，因為傳統的同源重組（HR）效率極低。最近發展起來的CRISPR/Cas9系統，可在合成的單導向RNA（sgRNA）的輔助下，用簡單的堿基互補，靶定和編輯特定的基因組位點。該CRISPR/Cas9系統已用于編輯各種生物的基因組，包括原核生物和真核生物。序列特異性核酸酶能有效地在DNA中產生雙鏈斷裂，并通過同源指導修復顯著增加HR的效率。
在這項研究中，研究人員構建了一個豬Oct4的報告系統，其中內源性Oct4啟動子可直接控制紅色熒光蛋白（RFP）。通過同源重組（HR），研究人員將2A-tdTomato序列插入并替換豬Oct4基因的終止密碼子。因此，熒光能準確地顯示內源性Oct4的激活。利用CRISPR/Cas9系統，研究人員獲得了在內源性Oct4基因啟動子下游具有tdTomato基因敲入的豬胎兒成纖維細胞（PFF）系。轉基因的PFFs可被用作體細胞核移植（SCNT）的供體細胞。
研究人員在SCNT胎兒的囊胚和生殖嵴中，檢測到了強大的RFP表達。通過SCNT，研究人員也制備了兩只有生活力的轉基因豬。通過另一輪SCNT對來自胎兒和仔豬的成纖維細胞進行重編程，可導致重構囊胚中的tdTomato再激活。結果表明，監測細胞多能性狀態的一個KI豬報告系統，已被成功構建。
上一篇： CRISPR發明專利究竟花落誰手？
