Nature子刊：TALEN/CRISPR介導的新型替代基因敲入技術
日期：2015-12-22 08:54:23
來自廣島大學的專任講師Tetsushi Sakuma、Takashi Yamamoto教授，專任副教授Ken-Ichi T Suzuki及同事們在《Nature Protocols》雜志上，報告了一種利用基因組編輯技術的替代基因敲入方法的精簡實驗方案。這一創新方法被稱作為PITCh系統。
基因敲入是通過用一種基因替換另一種基因，以便在體內測定它們是否具有相同的功能，或將正常基因引入基因組中置換突變基因以達到靶向基因治療目的的技術。基因敲入通常是通過共同導入可編程核酸酶和單鏈寡核苷酸或是包含左右同源臂的靶向載體，誘導同源重組（HR）依賴性的基因添加來實現。
盡管同源重組介導的基因敲入能夠精確插入大的DNA片段。構建靶向載體往往很費力，且在大多數培養細胞和生物體中同源重組活性都相對較低。這一問題為同源重組介導的基因敲入技術應用于生命科學領域設置了技術障礙。
相比于當前的方法，PITCh系統利用了TALENs 和CRISPR/Cas9技術借助微同源介導末端連接(MMEJ)，能夠更方便有效地將外源DNA插入到靶基因組位點中。這一新型的通用技術可幫助加快一些領域，如篩查候選新藥及構建人類疾病細胞或動物模型的研究進展。
基因組編輯是一種在遺傳工程中使用的創新技術，使得研究人員能夠在特定的位點改造基因組。在這一技術中，研究人員利用了稱作為“分子剪刀”的工程核酸酶來在基因組的預期位點造成DNA斷裂。當一些修復信號通路修復DNA斷裂時，可誘導包括將外源DNA插入到基因組中（基因敲入），和替代或移除靶基因組位點等遺傳修飾。
Sakuma說：“不同于當前的一些采用TALEN或CRISPR-Cas9基因編輯工具的技術主要利用DNA斷裂修復信號通路——同源重組，PITCH系統是一種獨立于HR的替代基因敲入方法。由于可變的同源重組率，現有的基因敲入技術無法適用于所有細胞類型和生物。因此，我們瞄準了另一條修復通路——MMEJ，開發出了這一PITCh系統。”
在這篇文章中，作者們描述了構建理想載體，將它傳染到細胞中，選擇基因敲入細胞，及檢查敲入的詳細實驗過程及一個真實的成功例子。此外，還描述了一種在青蛙胚胎中實現基因敲入的簡單方法。這篇文章將允許研究人員很容易地使用這一強大的工具，并促成生命科學基礎及應用研究的進展。
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