Nature Biotechnology：CRISPR脫靶的全基因組圖譜
日期：2014-12-17 10:00:37
CRISPR-Cas是時下最熱門的基因編輯工具。日前，麻省總醫院（MGH）的研究團隊開發了在基因組范圍內檢測CRISPR脫靶效應的全新方法，GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Indentification of DSBs Evaluated by Sequencing）。這一成果發表在十二月十六日的Nature Biotechnology雜志上。
“以往人們在檢測CRISPR-Cas核酸酶誘導的脫靶DNA斷裂時，往往事先假定脫靶位點與靶標位點相似。GUIDE-seq是首個不需要這樣做的方法，而且它相當靈敏，”這項研究的資深作者，哈佛醫學院的副教授J. Keith Joung說。“這對于評估CRISPR-Cas的臨床安全性非常重要。”
CRISPR-Cas RNA引導性核酸酶（RGN）通過斷開雙鏈DNA來引入遺傳學改變，RGN含有一個Cas核酸酶和一個與目標DNA序列互補的短RNA。去年Joung等人首次報告，當DNA片段與目標片段的差異在五個核苷酸以下，CRISPR-Cas RGN就會出現脫靶。這樣的脫靶突變會導致包括癌癥在內的副作用，鑒定并減少這些DSB是確保CRISPR臨床安全性的基礎。
研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來標記CRISPR-Cas誘導的脫靶斷裂，測序這些標簽所在的基因組區域，就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明，就算某個脫靶突變的出現頻率低至0.1%，GUIDE-seq也能夠檢測得到。由于許多脫靶突變發生在與目標位點差異很大的地方，因此脫靶DSB的數量和位置是很難預測的。
現有工具主要是通過分析目標序列來預測脫靶突變，研究人員將這些工具與GUIDE-seq進行了比較。研究顯示，上述工具在預測已驗證的脫靶位點時比GUIDE-seq差很多，還會錯誤檢出實際上不被酶切的位點。此外，研究人員還對比了GUIDE-seq和ChIP-seq（檢測蛋白與DNA的結合），結果證明ChIP-seq并不是鑒定 CRISPR-Cas脫靶DSB的可靠方法。
GUIDE-seq也可以用來鑒定普通細胞中的DSB熱點區域，“之前有許多文章描述過人類細胞的基因組脆弱位點，”Joung說。“用GUIDE-seq鑒定這些位點，不需要事先添加藥物來增強斷裂。我們驚訝的發現，不同細胞系的DSB大多發生在不同的位置。我們的研究表明，GUIDE-seq可以成為在活細胞中研究和監控DNA修復的有用工具。”
Joung等人之前曾經發表文章指出，縮短引導RNA能夠顯著改善CRISPR-Cas的精確性，減少全基因組中的脫靶DSB。他們在這項新研究中用GUIDE-seq驗證了這個方法的有效性。
Joung希望GUIDE-seq日后可以用來鑒定其他基因編輯工具誘導的脫靶斷裂。他還認為，在未形成細胞系的細胞中檢測脫靶效應是很重要的，這樣的結果更貼近基因編輯工具在臨床上的作用機制。
“GUIDE-seq是一個非常直觀的方法，我們打算在不久的將來把分析測序數據的軟件放到網站上，供非商業性質的研究人員使用，”Joung說，他已經為GUIDE-seq技術遞交了專利申請。
