重組抗體概述
日期：2023-09-21 17:12:06
自從抗體被發現以來，人們一直試圖利用抗體-抗原特異性反應的特點來輔助疾病的診斷和治療，從而推動了抗體生物工程技術在不同階段的發展。
眾所周知，單克隆抗體是由小鼠 B 細胞-骨髓瘤細胞融合雜交瘤分泌的，因此其鼠源性是不可避免的。雖然人源化雜交瘤細胞系可以解決這一問題，但其構建難度大，易發生染色體缺失而導致不穩定，無法實現人體免疫。人們設想制造一種能減少或避免鼠類抗藥性的人類抗體。1990 年，約翰-麥卡弗蒂證明了抗體的可變區可以顯示在絲狀噬菌體表面，這為重組抗體的出現奠定了基礎。
近年來，重組抗體在治療和診斷領域的應用日益廣泛和深入。與傳統抗體相比，重組抗體優勢明顯，越來越受到青睞。
那么，重組抗體有哪些優勢？它們為何如此受歡迎？也許我們應該從什么是抗體、抗體的化學性質、抗原-抗體反應、生物學功能、分類、生產、應用等方面入手。
在對抗體有了大致了解的基礎上，現在我們來談談重組抗體。重組抗體是抗體的一個小分支。本文將從定義、分類、生產、優勢、應用等五個方面介紹重組抗體。
1. 什么是重組抗體？
由于單克隆抗體藥物在臨床應用中的缺點，抗體治療一直沒有取得理想的效果。然而，隨著對抗體基因結構和功能以及分子生物學的進一步了解，科學家們開發出了一種新型抗體--重組抗體。
重組抗體又稱基因工程抗體，是一種利用合成抗體基因在體外生產的單克隆抗體。這些合成抗體基因通過 DNA 重組技術進行修飾和重組形成，構建在質粒上，然后轉移到適當的宿主細胞中進行表達。不同的是，單克隆抗體是通過雜交瘤技術在活體動物體內產生的。重組抗體的特點是重現性高、特異性強和可擴展性好。
2. 分類
2.1 嵌合抗體
從鼠特異性單克隆抗體中克隆的可變區（V）與人抗體的常量區（C）結合形成嵌合基因，將其插入表達載體，然后在原核或真核表達系統中表達。由此產生的抗體就是嵌合抗原。它具有良好的親和力和特異性，因為它保留了小鼠單克隆抗體的完整 V 區。去除小鼠單克隆抗體的 C 區后，小鼠蛋白的含量大大降低，從而在一定程度上減少了抗小鼠抗體的產生。但由于小鼠單克隆抗體 V 區的存在，人鼠嵌合抗體仍會引起抗 V 區抗體反應。
2.2 人源化抗體
人源化抗體是由 CDR 嫁接基因將人源抗體的 CDR（互補決定區）置換成小鼠單克隆抗體的 CDR 而產生的。它在很大程度上保留了母體小鼠單克隆抗體的親和力和特異性。其人源化比例可達 80%-90%，大大降低了異源抗體對人體造成的免疫副作用。
2.3 完全人源化抗體
通過轉基因或轉染色體技術將人類抗體基因轉入抗體基因缺陷動物體內。動物表達的人類抗體達到完全人源化。利用動物基因敲除和插入技術獲得的完全人源化抗體操作困難，成本高昂。而且還會引起人體排斥反應，因此噬菌體展示技術應運而生。
圖1. 重組抗體的開發
2.4 小分子抗體
所謂抗體就是全長抗體，包括輕鏈和重鏈的全長。由于全長抗體分子的分子量相對較大，在實際應用中經常會遇到組織滲透性差、易降解等問題。為了解決這些問題，科學家們開發了抗體片段，如 Fab 片段、單鏈可變片段（scfv）、單域抗體（sdab）等。
這些片段因分子量小、穿透力強、抗原性低、可在原核系統中表達、易于基因工程操作等特點而受到越來越多的關注。它們可以與抗原結合，也可以相互結合形成雙特異性抗體，還可以與酶類、生物素、熒光素、同位素、藥物、毒素或細胞因子等適當物質結合。它們適用于臨床診斷、共軛導向治療以及抗原抗體結合位點的 X 射線晶體衍射分析。
* 抗原結合片段（Fab 片段）
經木瓜蛋白酶處理后，兔 IgG 在核心鉸鏈處被裂解，產生兩個相同的 Fab 和一個完整的 Fc。Fab 片段保留了抗原結合區，分子量為抗體全長的三分之一。同時，由于缺少 Fc 片段，它的免疫原性較低，常被用作指導藥物載體和開發。
* 單鏈可變片段（scfv）
scfv 是抗體 V 區的單鏈片段，由抗體重鏈和輕鏈的 V 區通過多肽連接體連接而成。由于 scfv 保留了全長抗體的 V 區，因此其抗原結合位點不會改變，仍具有良好的結合特異性。此外，scfv 的多肽連接體還可根據需要設計成其他金屬螯合位點和連接藥物，因此是臨床應用的有力工具。
* 多價抗體
多價抗體是結合多種抗原的抗體。目前比較受關注的是“雙特異性抗體”，它是一種含有兩個特異性抗原結合位點的人工抗體，能在靶細胞和功能分子之間架起一座橋梁，從而產生定向效應作用。
3. 生產
重組抗體的生產可分為五個步驟：抗體基因庫的構建、噬菌體展示、抗體的分離、分離抗體的修飾以及在細胞培養表達系統中擴大所選抗體的生產規模。
3.1 構建抗體基因庫
抗體基因庫是由不同抗體的可變重（VH）和可變輕（VL）基因轉化而成的微生物集合。V 區基因可以在體外生成，也可以從產生人類抗體的 B 細胞的遺傳物質中擴增。
3.2 噬菌體展示
噬菌體是感染細菌的病毒，由包裹在蛋白質外層的 DNA 或 RNA 基因組組成。它們含有“外來”DNA 片段，并在大腸桿菌中復制。噬菌體展示不同于傳統的表達系統，它是將外源基因序列拼接到噬菌體外殼蛋白中，使外源氨基酸序列與外殼蛋白的內源氨基酸進行基因融合，產生雜合融合蛋白。
在噬菌體展示平臺上，抗體 V 區基因通常與編碼噬菌體表面蛋白的基因融合，并以融合蛋白的形式呈現在噬菌體表面。改造后的噬菌體感染細菌，載體和噬菌體共同破壞細菌的正常活動，使細菌細胞開始產生新的噬菌體，新噬菌體含有抗體基因，并在表面顯示功能性抗體片段。當雜交蛋白從細胞中釋放出來時，雜合蛋白就會融入噬菌體顆粒或病毒顆粒中，在表面顯示外來肽或蛋白結構域。
3.3 分離抗體
一旦顯示出重組抗體，就可以使用順磁珠、熒光激活細胞分選（FACS）或酶聯免疫吸附試驗（ELISA）來分離與特定抗原靶標結合的單個抗體。將感興趣的抗原與顯示抗體的微生物孵育，丟棄不與抗原結合的重組抗體。將結合的 rAb 從抗原上移除，篩選出所需的特征。
3.4 分離抗體的改造
對有前景的抗體進行大量培養，然后再次篩選出性能最高的候選抗體。如果候選抗體的親和力不夠強，則可通過隨機或合理誘變的方法使抗體“成熟”。抗體親和力成熟是一個在體內自然發生的過程。研究人員利用類似的體外過程來生產重組抗體。分子生物學技術，如定點誘變、易錯 PCR、DNA 洗牌或細菌突變菌株，可用于突變特定抗體片段的選定殘基，從而產生全新的文庫，并對其進行功能增強測試。
3.5 選定抗體的放大生產
一旦選定了所需的抗體，抗體基因就會通過表達載體轉移到表達系統中--一種專門設計用于表達外來蛋白質的細菌、酵母或哺乳動物細胞系。載體和表達系統的選擇取決于要生產的抗體類型。
全長抗體的表達最常見于酵母和哺乳動物表達系統。細菌表達系統速度快、成本低，但主要用于表達片段。
圖2. 重組抗體的生產過程
4. 優勢
與傳統抗體相比，重組抗體具有不可抗拒的優勢，這也是其逐漸興起的原因之一。
| 單克隆抗體 | 多克隆抗體 | 重組抗體 | |
|---|---|---|---|
| 重復性 | 高；批次之間的差異很小 | 低 | 較高；純度高，批次間差異較小 |
| 特異性 | 強 | 弱 | 強 |
| 生產周期 | 4 - 6個月的開發和生產 | 2 至 3 個月的開發和生產 | 4 個月開發；1 至 6 周生產 |
| 同工型轉換 | 困難 | 困難 | 簡單 |
| 表達系統 | 小鼠腹水法和體外法 | 常見于哺乳動物細胞（兔子） | 常見于哺乳動物細胞系，也可在酵母、細菌、昆蟲和轉基因植物的特制細胞系中表達 |
| 價格 | 生產成本高；需要更多專業人員操作 | 成本相對較低 | 需要專業技術知識以及大量的時間和資金投入來生產 |
| 人體免疫反應 | 不可避免 | 不可避免 | 可以避免 |
4.1 高度一致性和可重復性
由于重組抗體是由一組特定的基因產生的，因此抗體的產生是可控的，理論上可以構建針對任何抗原的重組抗體。同時，還可以避免雜交瘤引起的基因缺失、基因突變和細胞系漂移等問題。因此，批次與批次之間的差異非常小，結果的可重復性很高。
4.2 高靈敏度和特異性
使用重組技術，抗體特異性和靈敏度更容易通過抗體工程得到提高。在雜交瘤和重組克隆階段，我們就可以選擇所需的克隆，從而篩選出最優質的抗體。
4.3 生產周期短
建立抗體庫后，重組抗體的生產周期可短至 8 周。
4.4 無動物免疫
從合成或人類抗體庫中提取的重組抗體完全是非動物技術。這就解決了與傳統單克隆抗體生產相關的動物倫理問題（動物免疫、安樂死和腹水雜交瘤擴增）。
4.5 同工型轉換
重組抗體的序列可根據具體需要進行修改。一旦找到所需的抗體片段，通過添加適當的恒定結構域，就可以很容易地將其轉換為任何物種的任何抗體同種型。
不過，我們也需要認識到，重組抗體的生產存在一些障礙，如抗體產量較低，需要訓練有素、經驗豐富的技術人員。由于重組抗體生產的復雜性和密集型高技術，大多數科學家需要從外包公司獲得。
5. 應用
抗腫瘤： 重組抗體因其對腫瘤的靶向性和獨特的生物效應，主要用于肝癌和血液系統腫瘤。抗體作為導向分子，在靶點富集效應細胞和免疫激活因子，從而發揮殺傷作用。
抗病毒感染： 最新研究表明，人源化抗體在治療肝炎、艾滋病和其他呼吸道病毒感染方面顯示出強大的優勢。目前，針對狂犬病毒、流感病毒和巨細胞病毒的人源化抗體也處于實驗階段。
抗老年癡呆癥： 阿爾茨海默病（AD）是一種難治性神經退行性疾病，目前尚無明確的治療或預防方法。科學家已經證實，β 淀粉樣蛋白（Aβ）在腦組織中的積累是導致老年癡呆癥病理過程的關鍵。目前研究表明，Aβ低聚物對改善認知障礙或清除腦內Aβ斑塊具有一定的治療潛力，具有AD免疫治療的應用前景。
抗自身免疫疾病： 重組抗體藥物可以抑制過度的免疫病理反應，防止炎癥細胞的活化和細胞因子的釋放。使用抗體治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化癥效果顯著。
此外，具有抗凝血和抗血小板功能的重組抗體制劑在治療心腦血管疾病方面也發揮著重要作用。
總之，重組抗體是傳統抗體不斷優化的產物，它既具有單克隆抗體的優點，又彌補了單克隆抗體的不足。隨著科技的進步和創新，科學家們將會了解更多的重組抗體技術，最大限度地挖掘重組抗體藥物的潛力，使其更廣泛地應用于相關疾病的預防和治療。
