ELISA檢測影響因素淺析
日期：2023-03-27 11:05:07
酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）指將抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合的專一性，并結合酶對底物的高效催化作用， 通過底物的顯色反應及顏色深淺，進行定性或定量的一種檢測方法。
ELISA為固相非均相反應，依檢測原理，主要分為三種：夾心ELISA法、競爭ELISA法、間接ELISA法；夾心法又可分為雙抗體夾心法、雙抗原夾心法；競爭法有直接競爭法、間接競爭法。基于目的的不同，又可分為定量ELISA和定性ELISA。
ELISA作為起源于19世紀的一項成熟檢測技術，因其具有無可比擬的優點而應用廣泛。概括而言，其檢測主要操作步驟有加樣、溫育、洗板、顯色、判讀；相應的所需儀器則較普遍常用，如酶標儀（多功能酶標儀）、恒溫培養箱或水浴鍋、自動洗板機、微孔振蕩器；其他如排槍、量筒等實驗室更為常用。而對于實驗者來說，準確、完美、可重復性的實驗結果是最佳的，若要取得理想的ELISA實驗結果，需從影響ELISA檢測結果的因素著手，多加注意 [1]。縱觀全局，影響因素不外乎以下幾個方面：
一、樣品方面
ELISA作為一項成熟的檢測技術，適用于多種樣本的檢測。其中血清、血漿、尿液、唾液等樣本較為常見，規范的取樣操作、合適的存放條件都是保證檢測結果準確的必要條件。
實際上，樣本采集、存放過程中很多因素可能引起檢測結果的差異，如溶血樣本由于紅細胞裂解釋放出具有過氧化酶活性的物質，進而發生非特異性顯色反應，產生假陽性 [2]；部分資料顯示，對于溶血樣本，可以測定血清Hb濃度判斷溶血程度。非溶血標本血清游離Hb為4.8±3.2mg/dL，中度溶血血清Hb為43.5±13.9mg/dL。超過此范圍的樣本最好做復檢，避免假陽性結果。依據檢測指標，選擇合適的樣本，而對于較為敏感指標（如LDH、ACP等），即使輕微溶血也可能導致測定結果偏高，此類樣本應盡量避免使用。對于溶血判斷，較為簡易便捷的方法則是肉眼觀察，當血清清亮，呈櫻紅色，為中度溶血，此時需重新采集。為更好避免溶血情況發生，建議SST管或抗凝管采樣。高脂血同樣也是比較常見的，嚴重的也稱為牛奶血，呈乳白色或混濁狀，其通過不均一性、脂質顆粒粘附在管壁等影響檢測結果。理論采用高速離心可除去，但可能對檢測結果有影響。
另外，樣本污染或存放不當都會對檢測結果造成影響，如樣本受到細菌污染，則會產生非特異性顯色而干擾結果；塑料管能吸附抗原使樣本內抗原含量下降，容易假陰性，最好使用真空采血管。
二、操作方面
ELISA是一項可重復性很高的檢測技術，操作簡便易行，但操作中的各個環節對實驗的檢測效果影響較大，正確嚴格的操作是保證實驗成果的關鍵。
對于加樣：ELISA是基于微孔板的反應，所需樣本量較小，若樣本粘附于孔壁或加樣量不足，微孔板內樣本量不足以參與與抗原或抗體的反應，則會出現假陰性結果。因此充足的樣本量是首要條件，考慮使用準確性高的移液器且定期進行校正，加樣時宜垂直懸空加入微孔底部，需注意避免碰到管底或管壁，防止濺出或產生氣泡，同時更換槍頭，做到“一樣一吸頭”，避免交叉污染。
對于溫育：ELISA是基于抗原抗體特異性結合的反應，抗原抗體反應需要合適的溫度。對于大多數抗原抗體，37℃是最佳反應溫度，結合效率最高。ELISA操作中需將酶標板置于合適的溫度溫育，由于酶標板結構特別，較易產生邊緣效應，同時基于很多恒溫箱構造，溫度顯示并非酶標板溫育溫度，導致個別樣本檢測結果異常。可選用水浴法溫育，避免受熱不均產生邊緣效應，同時貼上密封膜防止污染或液體蒸發 [3]，切勿縮短溫育時間。
對于洗板：其目的在于除去非特異性成分，使免疫復合物與待測抗體 (抗原) 呈一定比例，洗板是ELISA操作中重要的環節。有條件的實驗室，可采用機洗，可在一定程度避免污染，提高效率，需注意觀察洗液針、沖洗頭是否通暢 [4]，這是考慮到血清中殘留纖維蛋白絲或洗滌液有析出的結晶存在時，易使洗板機針孔阻塞；調整注水量，設置好洗板時間及次數、力度，避免力度過大造成酶結合物丟失，檢測結果偏低。對于不方便的實驗室，則可用手洗，可反復模擬操作，避免洗板不干凈造成“花板”，影響檢測結果。洗板結束后將板垂直扣于干凈的吸水紙或毛巾上，拍干。
對于顯色及判讀：ELISA多用HRP為催化酶，作用于TMB發生顯色。顯色是最后一步溫育反應，研究表明，顯色溫度對實驗結果有明顯影響，溫度過低導致結合反應速率變慢，顯色不充分，容易漏檢低值結果。而顯色時間不宜過短，鑒于一些低滴度可能不能及時出現反應，造成假陰性結果。嚴格控制顯色反應的溫度和時間至關重要。ELISA測定需要通過酶標儀測定，研究資料建議首選雙波長，可以減少測定干擾和電路干擾 [1]，提高臨界值處的樣本的分析正確度，減少對弱陽性樣本的漏檢，從而減少實驗誤差。
三、試劑方面
市場ELISA產品眾多，眼花繚亂，參差不齊，高質量的產品仍然是重中之重 [5]，也是保證實驗結果可靠的先決條件。選擇知名度相對高的試劑。切忌不要混用，更不要使用過期試劑。實驗操作前，通常需將試劑從冰箱拿出，平衡30-60min，使微孔內溫度較快達到所需溫度，而忽略這一操作可能導致一些弱陽性的樣本出現假陰性。
綜上所述，影響ELISA結果的因素有很多，無論是樣品、操作還是試劑都可能影響到最終的實驗結果。因此，在進行ELISA檢測時，要采取相應措施排除干擾因素，同時嚴格執行SOP標準化規程，認真做好ELISA全程質量控制，保證ELISA檢測結果的準確度 [6]。
參考文獻：
[1] 石林，許亞寧，王炳濤，等. ELISA檢測方法中使用單、雙波長測量差異的比較[J].第四屆全國免疫診斷暨疫苗學術研討會. 2009,425-426.
[2] 王蘭蘭，柳永和，李雙慶，等. 臨床免疫學和免疫檢驗[M]. 第3版. 北京：人民衛生出版社，2005:256.
[3] 陳鶴，劉慶菊. 溫育溫度及時間對ELISA快速分析法檢測乙型肝炎標志物的影響[J].南華大學學報，2006,34(1):138-139.
[4] 莫浩聯.不同洗板方式的酶聯免疫法對HBsAg結果的影響[J].中華醫學研究雜志，2004,4(10):16.
[5] 許斌，朱定虎. ELISA檢測HBsAg影響因素的探討[J].臨床檢驗雜志，2000,8(4):231-234.
[6] 韓文明. ELISA檢測影響因素的分析[J].醫學信息，2011,12(24):12.
