外泌體|誰(shuí)與爭(zhēng)鋒——火得如日中天的研究“新秀”
日期：2020-10-22 13:52:19
2013年，外泌體因諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)而被眾人知曉，也因此將外泌體研究推向了前所未有的新高潮。外泌體在體液中廣泛存在及易獲得性等特點(diǎn)被譽(yù)為液體活檢"新秀"，成為疾病的精確診斷和治療研究的熱點(diǎn)。
外泌體（Exosomes）是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的直徑大約為30-150 nm 的具有脂質(zhì)雙層膜的微小膜泡，它廣泛存在并分布于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液和乳液等多種體液中。外泌體攜帶和傳遞重要的信號(hào)分子，包含細(xì)胞溶質(zhì)蛋白、 參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞活動(dòng)的重要調(diào)控，形成了一種全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。
為什么研究外泌體
作為液體活檢領(lǐng)域的"三大標(biāo)桿"之一，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊、疾病診斷和預(yù)后循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體，外泌體通過其攜帶的脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、miRNA等來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性，從而參與機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、腫瘤侵襲、抗原提呈等生物學(xué)過程。大量的證據(jù)表明外泌體及其內(nèi)容物具有成為新型診斷標(biāo)志物的潛能，在臨床和治療方面展現(xiàn)出了極具前景的研究?jī)r(jià)值。
國(guó)家自然基金項(xiàng)目查詢所示：近10年，外泌體相關(guān)項(xiàng)目數(shù)量從500上升到了接近2000個(gè)（數(shù)量上增加了近4倍）；資助金額增長(zhǎng)了近6倍。2019年的外泌體相關(guān)的國(guó)家自然科學(xué)基金中標(biāo)總計(jì)已達(dá)2.13億元，較2018年1.69億元增長(zhǎng)26%，2018較2017年1.23億元增長(zhǎng)37%。
外泌體受到越來(lái)越多的關(guān)注，涌現(xiàn)了大批的外泌體相關(guān)研究課題，以迅雷不及掩耳之勢(shì)火了起來(lái)。
外泌體最新研究進(jìn)展
外泌體從發(fā)現(xiàn)至今已有30多年的歷史，雖然最初被認(rèn)為可能是細(xì)胞的“垃圾”，所以才被排出來(lái)，但是近年來(lái)研究表明外泌體具有功能活性并可進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞。作為信號(hào)分子的載體，外泌體在生物體內(nèi)介導(dǎo)多個(gè)核心生物過程，包括免疫監(jiān)視、炎癥抑制反應(yīng)、干細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持與可塑性、鄰近和遠(yuǎn)端細(xì)胞的增殖與凋亡抑制等。
白癜風(fēng)是由自體表皮黑色素細(xì)胞的逐步破壞引起的皮膚脫色疾病。適應(yīng)性免疫中CD8+、Treg和Th17細(xì)胞失衡為特征的自身免疫性不耐受被認(rèn)為是造成白癜風(fēng)中黑色素細(xì)胞破壞的主要原因。Autoimmun Rev 9月刊的一篇文章調(diào)查了外泌體與白癜風(fēng)的關(guān)聯(lián)，強(qiáng)調(diào)了外泌體的免疫調(diào)節(jié)作用。在病理和生理?xiàng)l件下，外泌體途徑對(duì)于調(diào)節(jié)CD8+，Treg和Th17細(xì)胞都是必需的。在病理?xiàng)l件下，分泌的外泌體可影響疾病微環(huán)境中CD8+，Treg和Th17細(xì)胞的平衡，環(huán)境失衡可能破壞自身免疫耐受，導(dǎo)致白癜風(fēng)。另外，外泌體在黑色素生成途徑中，充當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞之間通信的介質(zhì)，可能也參與黑素小體的運(yùn)輸。
越來(lái)越多的研究表明脂肪組織、炎癥反應(yīng)、非酒精性脂肪性肝（NAFLD）和酒精性脂肪性肝（AFLD）與肝細(xì)胞肝癌（HCC）的發(fā)生密切相關(guān)。最近，美國(guó)北卡羅萊那中央大學(xué)的研究者們提出脂肪細(xì)胞分泌的外泌體（AdExos）和HCC分泌的外泌體（HCCExos）營(yíng)造了一個(gè)持續(xù)的慢性炎癥環(huán)境，導(dǎo)致HCC進(jìn)展。AdExos和HCCExos均含有細(xì)胞特異性的細(xì)胞內(nèi)分子，包括各種mRNAs、microRNAs、lncRNAs、circRNAs、脂質(zhì)、代謝物以及蛋白。作為自分泌或旁分泌的信號(hào)分子，這些內(nèi)含物能激活與細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤惡化相關(guān)的信號(hào)通路，形成腫瘤微環(huán)境中脂肪細(xì)胞和HCC的動(dòng)態(tài)互聯(lián)，造成HCC進(jìn)展。
外泌體市場(chǎng)/臨床應(yīng)用
腫瘤患者血清中分離的外泌體，其內(nèi)含物miRNAs的表達(dá)譜與腫瘤進(jìn)展緊密關(guān)聯(lián)。外泌體miRNAs被發(fā)現(xiàn)在反復(fù)凍融的環(huán)境里、在-208 °C的超低溫下存儲(chǔ)5年仍然保持穩(wěn)定。外泌體miRNAs的高穩(wěn)定性使其成為監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。目前已在多個(gè)腫瘤類型中，包括非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等，鑒定出可用于監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的外泌體來(lái)源的分子標(biāo)記。
2016年，依賴外泌體譜的腫瘤診斷產(chǎn)品在美國(guó)上市。ExoDx Prostate（IntelliScore）和ExoDx Lung（ALK）是基于液體活檢方法的兩種商品化檢測(cè)試劑盒，可分別用于檢測(cè)血清和尿液中前列腺癌或肺癌標(biāo)志物。對(duì)于肺癌和前列腺癌，常規(guī)的診斷方法是侵入性診斷法。而ExoDx Prostate（IntelliScore）使用非直腸指診尿樣，分析樣本中高分型前列腺癌患者攜帶的三種標(biāo)志物，然后使用專有算法分析結(jié)果并預(yù)測(cè)患病風(fēng)險(xiǎn)。同樣，ExoDx Lung（ALK）利用定量PCR方法分析血清中的外泌體RNA，可檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌中五種不同的EML4-ALK融合基因轉(zhuǎn)錄本，此方法可用于有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)人群的預(yù)后檢測(cè)。
由于外泌體具有與當(dāng)前用作藥物遞送系統(tǒng)的納米顆粒相似的特性，比如穩(wěn)定性、通透性、免疫原性較低、毒性較低、生物相容性高等，外泌體也可被用作臨床治療的給藥工具。臨床藥物研究中，除傳統(tǒng)的化療藥物外，天然產(chǎn)物和干擾小RNA已成功封裝在外泌體中，用于靶向治療乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
外泌體研究解決方案
外泌體分離提取：超速離心是從生物體液或細(xì)胞上清分離外泌體的傳統(tǒng)方法。采用外泌體抽提試劑盒，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量形態(tài)完好的外泌體，獲得的外泌體可用于下游外泌體標(biāo)記、電鏡分析、粒徑分析、Western Blot分析、熒光定量分析和二代測(cè)序等。
外泌體鑒定：對(duì)分離提取的外泌體進(jìn)行鑒定的經(jīng)典方案有：NTA分析（Nanoparticle Tracking Analysis）、電鏡分析、蛋白標(biāo)志物Western Blot鑒定等。
外泌體標(biāo)志物鑒定：利用經(jīng)典文獻(xiàn)中普遍采用的外泌體標(biāo)志物抗體，運(yùn)用Western Blot等檢測(cè)手段對(duì)外泌體標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。
外泌體大數(shù)據(jù)分析：外泌體蛋白質(zhì)譜分析、外泌體分泌蛋白篩選、外泌體microRNA測(cè)序、外泌體microRNA芯片分析、外泌體lncRNA芯片檢測(cè)等。
外泌體示蹤（染料-PKH67/PKH26/DIO/DIL）：PKH-67（green）親脂性染料，可以穩(wěn)定的與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光，PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。相比于PKH-67，PKH-26（red）具有更長(zhǎng)的半衰期，標(biāo)記在兔紅細(xì)胞上的PKH26半衰期長(zhǎng)達(dá)100天以上。
外泌體體外功能檢測(cè)：細(xì)胞增殖檢測(cè)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)、細(xì)胞遷移檢測(cè)、細(xì)胞侵襲檢測(cè)。
外泌體體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：體外注射動(dòng)物，觀察表型。
外泌體分離提取
外泌體的分離方法有很多種，常用的有超速離心法、密度梯度超速離心法、多聚物沉淀法（PEG）、免疫磁珠法、試劑盒分離法等。
商品化試劑盒多采用聚乙二醇沉淀法、超濾法和免疫學(xué)方法分離外泌體。
超速離心法和密度梯度離心法是最常用的外泌體純化手段。這兩種手段因獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費(fèi)時(shí)，而且對(duì)儀器設(shè)備要求高（需要超速離心機(jī)）且回收率不穩(wěn)定，純度也達(dá)不到要求。
多聚物沉淀法操作簡(jiǎn)便，不需要額外的設(shè)備，然而PEG沉淀會(huì)夾雜分離大量雜質(zhì)(蛋白、脂類等)，顆粒大小不均一，存在于分離物中的聚合物也可能會(huì)干擾下游分析。
免疫磁珠法利用包被單克隆抗體的磁珠結(jié)合外泌體，可保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高，但免疫沉淀需要特異性抗體，檢測(cè)成本高，且僅能捕獲表達(dá)特定抗原的目標(biāo)外泌體，效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，囊泡完整性是個(gè)調(diào)整，不利于下游實(shí)驗(yàn)。
綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)的方法提取到的外泌體，缺陷在于：收率較低，耗時(shí)長(zhǎng)、純度不高，外泌體囊泡不完整等。
鑒于上述問題，武漢華美生物工程有限公司研發(fā)的外泌體提取試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單可靠的方法可從細(xì)胞培養(yǎng)上清液，血清，血漿，乳液，尿液，唾液中提取完整的外泌體。該產(chǎn)品提取的外泌體囊泡適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、熒光定量（qPCR）和高通量測(cè)序等應(yīng)用。該試劑盒通過蛋白親和的方式分離外泌體，無(wú)需超速離心即可實(shí)現(xiàn)高效率地從各種類型樣本中提取高純度、囊泡結(jié)構(gòu)完整的外泌體，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、易操作的優(yōu)點(diǎn)。
武漢華美生物工程有限公司(www.tzmingka.cn)成立于2007年12月，是一家集科研、生產(chǎn)、銷售為一體的生物高新技術(shù)企業(yè)。并形成了以CUSABIO為品牌的ELISA試劑盒、蛋白、抗體等多種優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，遠(yuǎn)銷歐美日德等九十多個(gè)國(guó)家。
2018年3月31日，華美生物兄弟公司生之源與2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主蘭迪·謝克曼教授舉行簽約儀式，并建立諾貝爾獎(jiǎng)工作站。此舉大大助推了華美外泌體相關(guān)科研產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)！
華美生物研發(fā)的外泌體(Exosome)提取試劑盒廣泛兼容各種樣本類型和各種細(xì)胞上清液(如A375，HEPG2，PC-3，Hela，U87，MG63等)，為廣大生物醫(yī)學(xué)科研學(xué)者提供高質(zhì)量的產(chǎn)品與技術(shù)服務(wù)。
外泌體未來(lái)展望
外泌體爆炸性研究活動(dòng)已經(jīng)慢慢演變?yōu)榉肿俞t(yī)學(xué)的快速發(fā)展。外泌體在臨床醫(yī)學(xué)中有十分光明的應(yīng)用前景，主要是因?yàn)樗鼈兒胸S富的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測(cè)臨床狀態(tài)、診斷疾病、治療反應(yīng)、疾病進(jìn)展等。重要且有影響力外泌體研究領(lǐng)域會(huì)隨著高效率的外泌體分離技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展。
外泌體可作為生物標(biāo)志物用于疾病的診斷，也推動(dòng)了以外泌體為靶標(biāo)的治療方法研究或?qū)⑼饷隗w本身用作治療工具的研究。將外泌體用作治療工具的臨床研究正在開展之中，其目的是研究患者自身MSC分泌外泌體或健康捐贈(zèng)者體內(nèi)外泌體用于治療的安全性和有效性。這個(gè)趨勢(shì)下，外泌體用作藥物輸送系統(tǒng)作為基因治療的潛在載體有可能變得更加普遍。外泌體在癌癥中同時(shí)發(fā)揮免疫激活和免疫抑制功能，外泌體腫瘤免疫療法有望誕生抗癌疫苗。更全面的了解外泌體功能，促進(jìn)“有益”外泌體的分泌，抑制“有害”外泌體的分泌，從而實(shí)現(xiàn)疾病的預(yù)防與治療。隨著完整外泌體和它們的功能的逐漸解密，預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)，更多令人興奮的外泌體應(yīng)用將會(huì)出現(xiàn)。
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