Nanodiscs在膜蛋白中的應用
日期：2018-02-01 13:42:11
在上一期中，我們簡單介紹了去垢劑的基本性質及其在膜蛋白中的應用。在含有去垢劑的緩沖中，大部分膜蛋白可以維持穩定性和活性。但少數對去垢劑敏感的膜蛋白是不適宜含有去垢劑的緩沖條件的，具體表現為無法純化（例如純化出的膜蛋白十分雜且得率非常低），穩定性不好（易于降解或有明顯沉淀）和沒有活性（可能該膜蛋白對去垢劑敏感，或其活性需要磷脂雙分子層的結構）。針對這類膜蛋白，我們建議嘗試nanodiscs技術。目前，Nanodiscs技術在膜蛋白的分離、純化、結構研究和功能表征方面展現了重要的優勢。本文介紹nanodiscs的成分和結構，nanodiscs與liposomes的對比以及nanodiscs在膜蛋白中的應用。希望通過我們的介紹，可以幫助您進一步了解膜蛋白。
1.Nanodiscs的成分和結構
Nanodiscs的主要成分是合成磷脂和兩親性螺旋蛋白（amphipathic helical protein），也叫做膜支架蛋白（membrane scaffold protein，MSP）。膜支架蛋白與血清載脂蛋白相關，而血清載脂蛋白是高密度脂蛋白的主要成分。2個膜支架蛋白為帶狀，環繞著磷脂，如下圖Fig 1[1]，即盤狀磷脂雙分子層Nanodiscs。
2. 模型膜
我們主要對比liposomes和nanodiscs兩種模型膜。
2.1 Liposomes
Liposomes是兩親性脂雙層的囊泡。制備liposomes有許多方法，其中最有名最不要求設備的方法是Bangham法[2]。將目的脂質溶解于揮發性有機溶劑中，在惰性氣流下干燥。用水溶性緩沖渦旋所得的薄層脂質，然后通過各種方法，例如超聲、均質化和用尺寸已知的過濾器擠出（一般為100-200nm孔徑尺寸），最后轉化為單層囊泡。這也導致了liposomes非常明顯的劣勢，不穩定、不均質、難以復制等。
Liposomes易于聚集和融合，通常在長時間或在某些物理操作下是不穩定的，例如停止流動或劇烈混合。通過擠出機制備的liposomes尺寸并不是均質的，不同批次制備可能存在明顯差異[3]。組裝入liposomes中的膜蛋白通常會導致樣品渾濁和粘稠，這可能會限制一些生物化學分析技術的應用。
2.2 Nanodiscs
制備nanodiscs首先要準備包含磷脂、膜支架蛋白和去垢劑的混合物，一旦除去去垢劑，剩余的成分即組裝為直徑為8-16nm的盤狀磷脂雙分子層，即nanodiscs[4]。Nanodiscs的直徑由MSP帶的長度決定，當磷脂與MSP處于最佳摩爾比時，即形成均勻的nanodiscs。
對比liposomes，Nanodiscs的尺寸分布更加均質（在一次制備中）和一致（在不同批次的制備中）；nanodiscs有更加精準的顆粒尺寸大小，可以通過調節MSP的序列長度來調節大小；nanodiscs更加穩定。
3.Nanodiscs在膜蛋白中的應用
關于Nanodiscs的應用，已經有非常優秀的綜述[5]，關于結構的研究可具體見下表，可應用于結構生物學，適用于電子顯微鏡、NMR、EPR和光譜檢測技術等各種技術。
Table 1. Methods and tools used with MPs incorporated into nanodiscs
4.利用大腸無細胞蛋白表達和nanodiscs技術表達AQPs
Cusabio結合大腸無細胞蛋白表達和nanodiscs技術，在大腸無細胞蛋白表達體系中加入預組裝的nanodiscs。膜蛋白邊翻譯邊組裝入nanodiscs里，形成膜蛋白-nanodiscs復合物（Fig 2.）。這種模擬的人造脂質環境為分析不同的脂質對膜蛋白的影響提供了新的途經，讓我們更好的理解膜蛋白。下圖Fig 3.為 Escherichia coli Aquaporin Z(aqpZ)成功組裝入nanodiscs后，SDS-PAGE的檢測結果。由圖可見有2條帶，一條為MSP，一條為目的膜蛋白aqpZ。
下圖Fig 3.為 Escherichia coli Aquaporin Z(aqpZ)成功組裝入nanodiscs后，SDS-PAGE的檢測結果。由圖可見有2條帶，一條為MSP，一條為目的膜蛋白aqpZ。
Fig 2. Schematic illustration of a MSP nanodiscs with a 7-transmembrane protein embedded.Diameter is about 10.6 nm. Picture from Sligar.
Fig 3.
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往期回顧：
Refenrences
[1] Applications of Phospholipid Bilayer Nanodiscs in the Study of Membranes and Membrane Proteins. Abhinav Nath, William M. Atkins, and Stephen G. Sligar. Biochemistry, 2007, 46 (8), 2059-2069
[2] Large volume liposomes by an ether vaporization method. D Deamer, AD Bangham. Biochimica et Biophysica Acta, 443 (1976) 629-~34
[3] Applications of Phospholipid Bilayer Nanodiscs in the Study of Membranes and Membrane Proteins. Abhinav Nath, William M. Atkins, and Stephen G. Sligar. Biochemistry, 2007, 46 (8), 2059-2069
[4] Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Timothy H. Bayburt,Yelena V. Grinkova, and Stephen G. Sligar. Nano Letters, 2002, 2 (8), pp 853–856
[5]Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.Ilia G Denisov & Stephen G Sligar.Nature Structural & Molecular Biology 23, 481–486 (2016)
