RT-PCR

日期：2011-07-28 09:31:32

一、實(shí)驗(yàn)器具與材料：
1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭：1ml、200μl、20μl
3、勻漿管：5ml
4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、瓶：2個60ml的棕色瓶（廣口，帶蓋）
1個125ml的白色瓶（放無水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、試管架：5ml、1.5ml、20μl
10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水
11、鋁制飯盒：4個
12、塑料小飯盒：1個
13、大瓷缸：2個
14、錫泊紙：一卷
15、卷紙：2卷
16、三角燒瓶：帶蓋，稍大

二、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干）
3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）

三、配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）
3、異丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、瓊脂糖
四、幾種緩沖液的配制：
1、電泳緩沖液：
Tris 54g
      硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml？ pH8.0
蒸溜水 1000ml

5×TBE （貯存液）
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液+450ml水——→500ml工作緩沖液

2、上樣緩沖液：
0.25%溴酚藍(lán)
0.25%二甲苯青FF
30%甘油

6×緩沖液，4℃保存

五、瓊脂糖凝膠的配制：
1、1.0%：
1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進(jìn)行電泳。

2、1.5%:
同上，將瓊脂糖的量改為1.5g

六、需購置的Rt-PCR材料：
（生工. Tel. 2236106.）
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支    250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支    110
—— -20℃

DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
—— 4℃

Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
1、內(nèi)參照：
GAPDH
正義：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反義：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′

β-actin
正義：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反義：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′

2、par-4:
正義：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反義：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′

3、退火溫度計(jì)算
2（A+T）+4（G+C）
正反義平均數(shù)，再上下波動度（±4℃，或±5℃）

4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好

5、引物稀釋：
加DEPC水量為（μl）
= ? nmol / OD × 管上所標(biāo)OD數(shù)×100
是為10p mol / μl 濃度的引物溶液

八、PCR產(chǎn)物電泳
先將1-10μl左右PCR產(chǎn)物，加已點(diǎn)在紙上的溴酸蘭，反復(fù)吸打混勻后進(jìn)行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結(jié)果掃描打印。

九、幾個注意點(diǎn)：
1、逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴？
2、Rt時，先打開PCR預(yù)熱30分鐘。
3、RNA抽提前，打開離心機(jī)預(yù)冷。

在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。
6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分離與純化
真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞mRNA的3’端存在 20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。