病毒分離前樣品的預處理方法

日期：2010-08-06 14:02:15

毒含量較高的樣品浸出液或體液，可不經過病毒分離直接用于診斷鑒定。病毒含量較少的樣品，則需通過病毒的分離增殖來提高診斷的準確性和鑒定的可靠性。病毒分離首先要對樣品進行適當的處理，然后接種實驗動物或培養的組織細胞。

(一)組織器官樣品的處理

1、用無菌操作取一小塊樣品，充分剪碎，置乳缽中加玻璃砂研磨或用組織搗碎機制成勻漿，隨后加1-2ml Hanks平衡鹽溶液制成組織懸液，再加1-2ml繼續研磨，逐漸制成10%-20%的懸液；

2、加入復合抗生素；

3、以800×g離心15min；

4、取上清液用于病毒分離。必要時可用有機溶劑去除雜蛋白和進行濃縮（見下文）。

(二)糞便樣品的處理

1、加4g的糞便于16ml Hanks平衡鹽容液中制成20%的懸液；

2、于密閉的容器中強烈振蕩30min，如果可能則加入玻璃珠；

3、以6000×g低溫離心30min，取上清液再次重復離心；

4、用450nm的微孔濾膜過濾；

5、加二倍濃度的復合抗生素，然后直接用于病毒分離或進行必要的濃縮后再行病毒分離。

(三)無菌的體液（腹水、脊髓液、脫纖血液、水泡液等）和雞胚液樣品　

可不做處理，直接用于病毒分離。

注：Hanks平衡鹽溶液和復合抗生素的配制見細胞培養溶液的配制。

(四)樣品的特殊除菌處理　

樣品經過上述一般處理即可用于病毒分離，但對某些樣品用一般方法難以去除的污染，則應考慮配合如下方法進行處理：

1、乙醚除菌　對有些病毒（如腸道病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等）對乙醚有抵抗力，可按冷乙醚：樣品=1：1（V:V）加入，懸液充分振蕩，置4℃過夜。取用下層水相分離病毒。

2、染料普魯黃（Proflavin）除菌　由于其對腸道病毒和鼻病毒很少或沒有影響，常用作糞或喉頭樣品中細菌的光動力滅活劑。將樣品用0.0001mol/L pH9.0的普魯黃于37℃作用60min，隨后用離子交換樹脂除去染料，將樣品暴露于白光下，即可使其中已經被光致敏的細菌或霉菌滅活。

3、過濾除菌　可用陶土濾器、瓷濾器、石棉濾器或者200nm孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜等除菌，但對病毒有損失。

4. 離心除菌　用低溫高速離心機以1800r/min（15.24cm）離心20min，可沉淀除去細菌，而病毒（小于100nm）保持在清液中。必要時轉移離心管重復離心一次。

(五)待檢樣品中病毒的濃縮　

對病毒含量很少的病毒樣品用一般普通方法不易檢測或分離出病毒，必須經過濃縮。常用濃縮方法如下：

1、聚乙二醇（PEG）濃縮法　將分子量6000的PEG逐步加入經一般處理的樣品溶液中，使終濃度為8%，置4℃過夜。以3000×g離心15min，用少量含復合抗生素的Hanks平衡鹽溶液重懸，必要時用450nm微孔濾器除去真菌孢子。詳情可參考一篇經典文獻：Concentration and purification of viruses and bacteriophages with polyethylene glycol.(http://www.springerlink.com/content/v102563826774171/)

2、硫酸銨濃縮法　將等量飽和硫酸銨溶液緩慢加入經過上述一般處理的樣品溶液中，邊加邊攪拌，置4℃過夜。離心同上。

3、超濾器濃縮法　是一種高效率的濃縮法，特別適合大體積的樣品濃縮。

4、超速離心濃縮法以40000r/min（15.24cm）離心60-120min,絕大多數病毒將沉于管底。用少量Hanks平衡鹽溶液懸浮病毒。這種方法回收效率很高，但僅適用于小體積的樣品。

(六) 病毒分離樣品脂類物質的去除

有些病毒樣品（如組織樣品）脂類和非病毒蛋白含量很高，必要時在濃縮病毒樣品之前可用有機溶劑抽提。常用的有機溶劑有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是將預冷的等量有機溶劑加入樣品中，強烈振蕩后，1000×g離心5min，脂類和大量非病毒蛋白將保留在有機相中，病毒保留在水相中。應當注意的是，病毒必須對這些有機溶劑有抗性。